军团菌Ⅳ型效应因子RidL的结构生物学研究

发布时间：2017-04-29 02:07

  本文关键词：军团菌Ⅳ型效应因子RidL的结构生物学研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：严重感染嗜肺型军团菌(Legionella pneumophila)后,可能会发展成军团菌病(Legionnaires'disease)。在嗜肺型军团菌通过内吞作用进入宿主细胞后,利用自身Icm/DotⅣ型分泌系统分泌RidL效应蛋白分子。RidL定位于LCV囊泡膜上,通过与逆向运输复合物(Retromer complex)中的Vps29亚基相互作用,改变逆向运输复合物的功能,从而影响宿主的逆向膜泡运输通路,进而利于细菌在LCV中繁殖。然而RidL和Vps29详细的相互作用方式以及RidL的调节机理都不清楚。 为了回答上述问题,本文利用大肠杆菌表达系统,表达RidL(183-734)一段截短序列。经过多个纯化步骤,包括亲和纯化、离子交换层析、分子筛层析等,得到纯度较高、性质稳定、均一且适合进行晶体学研究的蛋白样品,最终浓缩到20mg/ml。经过初步筛选、后续优化等多步探索和尝试,本文得到了RidL(183-734)单个蛋白的晶体,经过X衍射处理,native晶体可以得到分辨率达2.7A的数据。用代谢缺陷型菌株B834,我们表达并纯化得到了RidL(183-734)硒代衍生物的蛋白,并优化得到其晶体,其X衍射分辨率可达3.5A。native和硒代衍生物晶体经初步晶体学分析可确定其空间群为C2。晶胞参数为：a, b, c (A):259.64,78.394,70.07; α,β,γ(°):90.00,91.49,90.00。本文用分子、生化、结构等方法,首次得到RidL晶体学数据,探索了一系列对RidL结晶的方法。本文的研究有助于进一步解析RidL的晶体学研究和阐明其发挥功能的分子机制。
【关键词】：嗜肺型军团菌 逆向运输复合物 RidL 晶体结构 X射线衍射
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 致谢5-7
• 摘要7-8
• Abstract8-13
• 第1章 绪论13-23
• 1.1 军团菌13-14
• 1.1.1 嗜肺型军团菌(Legionella pneumophila)13-14
• 1.1.2 军团菌病(Legionnaires’disease)14
• 1.2 嗜肺型军团菌与分泌系统14-17
• 1.2.1 革兰氏阴性菌的分泌系统14-16
• 1.2.2 Tcm/Dot Ⅳ型分泌系统16-17
• 1.3 嗜肺型军团菌侵染过程17-19
• 1.3.1 进入宿主细胞17-18
• 1.3.2 LCV(Legionella-containing vacuoles)18-19
• 1.3.3 离开宿主细胞19
• 1.4 逆向运输与Retromer复合物19-20
• 1.5 RidL在侵染中的作用20-21
• 1.6 本研究的意义21-23
• 第2章 实验材料和实验方法23-47
• 2.1 材料23
• 2.1.1 实验材料23
• 2.2 实验用酶、试剂、试剂盒23-24
• 2.2.1 分子克隆23
• 2.2.2 蛋白表达与纯化23-24
• 2.2.3 蛋白质结晶24
• 2.3 主要实验仪器24-25
• 2.4 试剂配制25-29
• 2.4.1 常用试剂部分25-26
• 2.4.2 SDS-PAGE所需药品26
• 2.4.3 SDS-PAGE蛋白电泳胶26-27
• 2.4.4 硒代蛋白表达部分27-28
• 2.4.5 亲和纯化及柱层析所用的缓冲液28-29
• 2.5 实验方法29-47
• 2.5.1 RidL基因克隆29-33
• 2.5.2 目的基因的鉴定33-35
• 2.5.3 RidL蛋白的表达35-38
• 2.5.4 RidL蛋白纯化38-41
• 2.5.5 蛋白结晶41-43
• 2.5.6 晶体的优化43-45
• 2.5.7 衍射数据收集45-47
• 第3章 实验结果与讨论47-63
• 3.1 RidL的表达47
• 3.1.1 RidL的小量表达47
• 3.1.2 RidL的大量表达47
• 3.2 RidL的纯化47-52
• 3.2.1 蛋白大量表达47-48
• 3.2.2 亲和纯化48-49
• 3.2.3 离子交换纯化49-50
• 3.2.4 分子筛纯化50-51
• 3.2.5 RidL硒代蛋白的表达和纯化51-52
• 3.3 RidL结晶和晶体的优化52-58
• 3.3.1 初步筛选52-54
• 3.3.2 晶体优化54-58
• 3.4 RidL晶体衍射和数据处理58-63
• 3.4.1 配制合适的防冻液58
• 3.4.2 确定相位58-59
• 3.4.3 衍射数据的收集和处理59-61
• 3.4.4 提高RidL重原子衍生物分辨率的方法探讨61-63
• 第4章 小结与展望63-65
• 参考文献65-71
• 作者简介和科研成果71

【共引文献】

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