人胚胎干细胞多基因同时抑制系统的建立

发布时间：2021-08-24 20:56

　　目的·在人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）中构建基于CRISPR干扰系统的多基因同时抑制系统,作为研究家族基因功能和构建多基因疾病模型的工具。方法·通过Golden Gate克隆法在hESCs中建立受强力霉素（doxycycline,Dox）调控的多基因CRISPR干扰系统。该系统主要由2个质粒组成:1个质粒在Dox调控下融合表达核酸酶失活的CRISPR相关蛋白9（nucleasedeactivated CRISPR-associated protein 9,dCas9）和Krüppel相关盒（Krüppel-associated box,KRAB）抑制结构域（dCas9-KRAB）,另1个质粒可同时表达8个独立的导向RNA（guide RNA,gRNA）来分别引导dCas9-KRAB蛋白到基因组特定位点抑制转录起始或延伸。以基因组DNA为模板进行PCR,确定2个质粒是否整合至细胞基因组,并通过Western blotting确定细胞在Dox诱导下是否可表达dCas9-KRAB蛋白。结果·使用这种可调控的多基因CRISPR干扰系统,可在Do... 

【文章来源】：上海交通大学学报(医学版). 2019,39(05)北大核心CSCD

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【部分图文】：

通过Dox诱导抑制多基因的表达导致hESCs分化Fig4Dox-inducedinhibitiono注：荧光实时定量PCR实验检测idCas9-M8细胞在Dox处理5d后多能性相关的基因（A）、滋养层相关基因（B）以及内胚层（C）、中胚层（D）


本文编号：3360708