三种帕金森病模型大鼠的步态分析

发布时间：2017-04-30 04:09

  本文关键词：三种帕金森病模型大鼠的步态分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景：帕金森病(Parkinson's disease, PD)作为一种常见的中枢神经系统神经退行性疾病,主要的病理发病机制为中脑黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNC)多巴胺能神经元退化缺失,从而引起肢体静止性震颤、肌肉僵直、运动迟缓等三大运动症状。但随着病程进展,在晚期PD患者中,步态障碍与姿势不稳逐渐成为另一常见的运动症状之一,并时常引起患者行走时摔倒甚至致残,严重影响着患者的生活质量。因此,如何改善PD患者步态障碍成为临床热点问题。以往科研中,PD模型的造模方式多种多样,其中通过将神经毒素6-羟多巴胺(6-hydroxy dopamine,6-OHDA)注入大鼠脑内制成PD大鼠模型进而研究PD的发病机制及各种评估治疗方案的方法已经在应用广泛。通过分别向大鼠脑内纹状体(the caudate putamen, CPU)、前脑内侧纵束(the medial forebrain bundle, MFB)和黑质致密部(the substantia nigra compact, SNC)三个不同部位注射6-OHDA能引起相关脑区不同程度的损伤,与此同时造成不同的步态障碍行为表现。以往实验用来验证PD模型大鼠造模效果以及评估新治疗效果的行为学方法包括转棒试验、跑台试验、旷场试验、圆柱体试验(既前肢不对称试验)和阶梯试验等。然而这些行为学试验结果的准确性受到诸多方面的干扰,其中包括测试时间(白天与黑夜)、训练频次、测试环境、测试者的主观性、对动物行为的强迫性以及测试指标的单一性等等。这些因素导致行为学实验结果的不稳定、不客观、不全面。另外,实验者只能从单一静态或动态指标去分析结果,不能综合考虑评价动物行为变化等。因此,即便以往科研试验已经投入大量精力去评估PD动物模型的步态障碍行为表现,然而其有效性仍有待进一步提高。目的：在本实验中,我们用CatWalk啮齿类动物自动步态分析系统有效地评估了三种不同偏侧PD大鼠模型的步态障碍表现。由于黑质纹状体系统多巴胺神经元的毁损是行为改变的直接原因,因此我们也在病理上评估了PD大鼠模型SNC与CPU的络氨酸羟化酶蛋白表达(tyrosine hydroxylase, TH)并研究其与PD大鼠步态指标的相关关系。方法：1、实验分组：本实验所用动物为SPF(Specified Pathogen Free)级的雄性SD大鼠(Sprague Dawley rat),每天每只予以饲料12-14g,饮水不限,控制体重290-310 g。实验采用随机分组方法,将实验所用SPF级SD大鼠随机分为3组,每组12只：CPU组、MFB组、SNC组。2、CatWalk的数据采集：所有实验大鼠在正式CatWalk实验前需进行适应性训练,并在训练合格后采集步态基线。训练过程与正式实验相同,既将背景灯光打开后,将大鼠放入CatWalk通道仍其自由来回行走在通道中。训练时期保证每只大鼠一天早晚各接受一次训练,训练中完整不间断地跑过通道3-5次,训练阶段保证在暗室中操作,使大鼠适应整个行为过程。训练时期内保持大鼠体重稳定,每天每只大鼠给予饲料约12-14g,饮水不受限制。训练开始前4小时予以禁食水,训练结束后予以恢复饮食,以此形成稳定的行为奖赏机制。训练阶段合格的标准为大鼠能够连续不到地通过CatWalk通道,每天至少5次。训练阶段结束后剔除不合格大鼠,这些大鼠行为学数据将不列入考虑范围。训练阶段结束后,将训练合格的老鼠采集术前CatWalk基线,并在立体定向毁损术后26天至30天再次行CatWalk数据采集。一切行为学数据采集后,将大鼠灌注取脑组织标本后进行免疫组化染色,评估CPU及SNC多巴胺毁损程度并与行为学进行相关分析。3、模型的制作和刺激电极的植入：所有大鼠经过腹腔注射戊巴比妥(40mg/Kg)麻醉后在手术台上摆好俯卧位,连接并固定好立体定位仪。固定好外耳道及门牙板,将齿杆调节至耳杆下3.3mm,使颅骨平面成水平位。术前予以大鼠眼部涂抹红霉素防止角膜过于干燥导致的角膜损伤。首先将大鼠头部剔除毛发并消毒清理干净。然后再次严格消毒手术部位及周围皮肤后纵行切开头顶皮肤,切口长约1.5cm,钝性分离骨膜后,用3%医用双氧水棉球沾涂并清理颅骨表面至前囟明显显露出来。术前查阅Paxinos and Watson的《大鼠脑立体定向图谱》以确定核团坐标。使用小型磨钻在颅骨钻孔,按已确定的坐标将10ul的微量注射器缓慢进针到预定深度,缓慢注射3ul 3.5ug/ul的6-OHDA溶液(用含有0.2mg/ml的抗坏血酸的生理盐水溶解),注射速度为0.5ul/min,留针5min,轻柔缓慢退针。用骨蜡覆盖钻孔,将皮肤缝合。其中右侧纹状体(CPU)坐标：前囟前1.2mm,向右旁开2.5mm,硬膜下5.0mm；右侧前脑内侧纵束(MFB)坐标：前囟后4.4mmm,向右旁开l.lmm,硬膜下7.8mm；右侧黑质致密部(SNC)坐标：前囟后5.3mm,向右旁开1.7mm,硬膜下7.2rnm。手术结束后,将大鼠恢复术前饮食,每天每只控制进食饲料12-14g,饮水不受限制,注意控制体重。4、获取病理：所有大鼠在接受最后一次CatWalk行为学检测后予以灌注取脑组织进行病理切片。大鼠常规腹腔注射戊巴比妥(40mg/Kg)麻醉后在手术台上摆好仰卧位。麻醉后将大鼠腹腔打开,往上从膈肌进入胸腔,膈肌剪开后快速充分暴露心脏,持14号钝针头从心尖部穿进左心室直至主动脉出口,剪开右心耳,快速灌注室温下0.9%生理盐水,液体量约250ml/只。直至从右心耳流出清亮液体并肝脏颜色均匀变白后将灌注液换成冰冻4%多聚甲醛250m1,滴速先快后慢,总时间约30分钟。内固定结束后将实验大鼠头部解剖取脑组织,并放入4%多聚甲醛溶液内室温固定12小时,然后再放入25%蔗糖冰冻溶液中过夜充分脱水直至沉淀,以防止冰冻切片结晶过多。脑组织脱水沉淀后,将25%蔗糖溶液倾倒干净,放入-20摄氏度冰箱内保存,或者直接取出脑组织用生理盐水冲洗干净后,根据大鼠脑解剖定位图谱切取并修整脑组织,切取范围应该包括纹状体和中脑部位,以进行下一步冰冻切片操作。将切取好的脑组织平整摆放在冰冻切片机组织支撑器上,周围填满包埋剂,放入冰冻切片机冰冻台上固定,冰冻切片机温度始终保持在-24摄氏度左右。将固定组织的支撑器夹紧于切片机上,调节进退按钮使组织刚好轻微接触刀片上,固定好刀片并调整放卷板,将切片厚度设置在20um,转动切片机旋转轮开始修整组织平面。修整好初始平面后开始正式切片,每隔三张切片保留2张,每隔部位共15组30张切片,根据Paxinos and Watson的《大鼠脑立体定向图谱》确定纹状体(CPU)的部位在前囟前2.5mm-前囟后1.5mm,黑质致密部(SNc)的部位在前囟后4.5mm-6.3mm。通过图谱寻找大致组织部位。将切好的冰冻切片放入-20摄氏度冰箱内保存,以备免疫组化染色所用。5、免疫组化：(1)取出保存好的冰冻切片恢复室温30min后,用配好的PBS缓冲液滴于组织上,覆盖完全后浸泡3分钟后倒掉PBS溶液再进行下一步清洗,切忌冲洗过度将组织冲离玻片。清洗时间及次数为3分钟×3次；(2)清洗干净后的组织用0.3%的Triton X-100破膜30分钟,以便后续能与组织充分反应；(3)清洗干净后的组织用3%H202去离子水浸泡8分钟后,充分灭绝内源性过氧化物酶后继续用PBS缓冲液清洗,清洗时间及次数亦为3分钟×3次；(4)将配好的0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液(PH 6.0)倒入小烧杯中,倒入量为能覆盖玻片组织上2公分,放入微波炉中加热至沸腾后熄火取出,将经双氧水处理后的玻片在烧杯表面预热后放入其中,切勿直接放入,以免组织瞬间热胀后脱片,缓慢放入0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液(PH 6.0)后放置5分钟,再将烧杯重新放入微波炉中用小火加热至即将沸腾后马上熄火,取出后放置5分钟后再次放入微波炉中加热,如此仿佛加热3次后取出静置,直至恢复室温后,用PBS缓冲溶液清洗,3分钟×3次；(5)清洗完毕后山羊血清封闭液(含0.3%的TritonX-100)室温孵育1h,倾去表面多余血清； (6)封闭结束后用配好的1：1000的TH一抗稀释液(含0.3%的Triton X-100)在湿盒中放好并置于4℃冰箱内孵育过夜12小时,结束后从冰箱取出恢复室温30分钟,再用PBS缓冲液冲洗,3分钟×3次；(9)滴加1：200山羊抗小鼠IgG抗体-Fab段-HRP多聚体二抗(含0.3%的Triton X-100)并置入37℃的水浴恒温箱中孵育30分钟；取出后用PBS缓冲液清洗3分钟×3次； (11)DAB显色：滴入DAB显色剂,显微镜下观察室温显色1～3min, PBS冲洗终止显色,风干后用中性树胶封片剂封片。6、细胞计数与平均光密度分析：应用DM4000B光学显微镜及拍照系统采集CPU及SNC所在平面照片。在IPP6.0图像分析软件下每隔6个层面计数SNC免疫反应阳性神经元的数目。即将制得的切片在40倍物镜下计数的阳性神经元数目。应用IPP6.0图像分析软件从CPU四个冠状层面(+1.2,0.8,0.00 and -0.4mm)测量免疫反应阳性纤维的平均光密度(average optical density, AOD)。每只大鼠的不同层面所得测量值取平均值后进行统计学分析。将测得的AOD值与大脑皮层进行校对。将测得的SNC的神经元数以及校对后的AOD值进行左右两侧对比取得百分值为最终病理数据。7、统计学方法：本实验所有数据采用SPSS 19.0统计软件分析数据,计量资料用“均数±标准差”表示,立体定向术前后的行为学数据均数比较采用配对样本t检验,组间及组内行为学数据的比较采用One-way ANOVA及Bonferroni post hoc检验方法。SNC及CPU内TH的表达水平与行为学参数间的相关性采用Pearson's相关分析方法。所有校验以P0.05为差异有统计学意义。结果：1、应用IPP6.0图像分析软件测量出TH阳性神经元数并与对侧进行对比发现,同侧的黑质致密部TH免疫阳性(THir)的神经元显著减少,百分比值显著减小。MFB组及SNC组未注射6-OHDA的黑质致密部可见到较多的THir神经元,已注射6-OHDA的黑质致密部的THir神经元大部分消失(其中MFB组损毁侧与健侧对比7.3±4.4%；SNC组为12.6±8.2%)。大鼠的左右侧THir神经元细胞计数结果相比较均有统计学差异(P0.05),而相比之下,CPU组损毁效果较轻(损毁侧与健侧对比为35.3±15%)。各组的PD模型成功。应用IPP6.0图像分析软件从CPU四个冠状层面(+1.2,0.8,0.00 and -0.4mm)测量免疫反应阳性纤维的平均光密度(AOD),结果与细胞计数类似。对侧进行对比下同侧的纹状体TH免疫阳性神经纤维的AOD值显著减少,百分比值显著减小。MFB组及SNC组健侧可测得较高的AOD值,损毁侧的纹状体的AOD值大幅降低(其中MFB组损毁侧与健侧对比7.7±3.5%；SNC组为12.7±8.1%)。大鼠的左右侧TH免疫阳性神经纤维的AOD值结果相比较均有统计学差异(P0.05),而相比之下,CPU组损毁效果较轻(损毁侧与健侧对比为35.4±14.6%)。通过单因素方差相关分析可以发现MFB组与SNC组的模型在病理表现上要比CPU组损毁更彻底(P0.05),而MFB组与SNC组之间的PD模型的TH损毁程度并没有统计学上差异(P0.05)。2、手术后4周,PD模型大鼠的步幅、摆动速度、患侧肢体的最大接触面积以及平均压力比术前减少,然而支撑相时间、步幅周期、后侧肢体的支撑相比例、终末双侧站立时间、以及支撑基数较术前增大,差异均有统计学意义(P0.05)。3、另一方面,MFB组在各个步态参数上要比CPU组损毁更彻底,而SNC组与MFB组类似,除了支撑相比例这一参数外,其余参数均比CPU组损毁严重。然而,MFB组与SNC组之间平均平均压力、步幅、摆动速度、步幅周期、支撑相比例、以及终末双侧站立时间对比有统计学差异(all P0.05)。4、最后本实验发现MFB组和SNC组PD模型大鼠在脚爪最大接触面积、平均压力以及终末双侧站立时间这三个参数上左右肢体间存在统计学差异(allP0.05)。而CPU组PD模型大鼠除了前脚爪的最大接触面积(患侧小于健侧,P0.05)和四肢终末双侧站立时间(患侧长于健侧,P0.01)左右侧肢体间存在统计差异外,其他参数左右肢体间均无统计学差异。5、PD大鼠的摆动速度、步幅、患侧肢体的爪印最大接触面积以及平均压力与TH免疫阳性水平成显著正相关。而支撑相时间、终末双侧站立时间、步幅周期、支撑相比例以及前肢的支撑基数与TH免疫阳性水平成明显负相关。结论：1、MFB组与SNC组偏侧PD模型大鼠的步态障碍表现比CPU组更明显。2、大多数步态参数与SNC及CPU核团上TH蛋白表达水平有着显著的相关关系。3、CatWalk自动步态分析系统能够从静态及动态指标上去客观、准确、自动地检测及分析PD模型大鼠的步态变化。
【关键词】：帕金森病 步态 CatWalk 6羟多巴胺 神经化学相关性
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.5;R-332
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-17
• 第一章 前言17-20
• 第二章 材料与方法20-28
• 2.1 实验材料20-23
• 2.2 实验方法23-28
• 第三章 结果28-35
• 3.1 大鼠的剔除情况28
• 3.2 免疫组化染色结果28-29
• 3.3 大鼠CatWalk自动步态检测结果29-33
• 3.4 步态参数与TH免疫阳性率的相关分析33-35
• 第四章 讨论35-38
• 4.1 CatWalk自动分析系统数据分析35-37
• 4.2 不同部位注射6-OHDA制作不同程度模型37
• 4.3 步态参数与病理表现的相关分析37-38
• 第五章 结论38-39
• 参考文献39-42
• 综述42-57
• 参考文献52-57
• 中英文缩略词对照表57-58
• 攻读学位期间成果58-59
• 致谢59-61

【共引文献】

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本文编号：336199