抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体的构建、表达及生物学活性检测

发布时间：2021-08-28 01:37

　　BiTEs（bispecific T cell engagers）是以T细胞作为效应细胞的双特异性单链抗体,它采用单链抗体技术,将两个不同抗体的重链及轻链可变区连接在一条多肽链上,并作为活性蛋白在CHO细胞中进行分泌表达,其基本的形式是V_L1-linker-V_H1-linker-V_H2-linker-V_L2。BiTEs具有两个抗原结合部位,可以同时和T细胞及病变细胞表面的抗原分子结合,从而有效地激活静止的T细胞来达到杀伤病变细胞的目的。抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体是一种BiTEs形式的极具潜力的新型工程抗体,它以CD20为靶标,具有靶向杀伤B细胞淋巴瘤的功能。 本实验通过重叠延伸PCR扩增获得抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体完整基因片段:前导序列—VL_CD3—（G₄S）₃—VH_CD3—（G₄S）₃—VH_CD20—（G_4<... 

【文章来源】：中国人民解放军军事科学院北京市

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

通过Nhel、Notl酶切鉴定转化子中的阳性质粒

30001200图1一7通过Nhel、Notl酶切鉴定转化子中的阳性质粒测序结果发现，4#质粒700一1619bp经测序全部正确，用Bgl11和Notl双酶切下700一1619bp作为片段a，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收。5#质粒1一70Obp经测序在413bp处发生碱基缺失突变，用Nhel和Bglll双酶切1一700bp的片段，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收。采用重叠延伸CPR的方法修改该片段的突变，得到片段b。将片段a、b连入pDcNA3.l载体，序列分析知目的基因正确连接到载体上

实验结果分别收集转染2h4、3h6后的COS一7表达上清，采用直接竞争法ELIAs检测后显色(图2)及0D450nm测量结果(表2)，并与空白对照和阴性对照相比较，可以证明抗DC3/抗DC20双特异性单链抗体在COS一7细胞中进行了瞬时表达，且在转染36h时表达较高，这说明了我们构建的抗Dc3/抗CD20双特异性单链抗体可以在哺乳动物细胞中进行分泌表达，其前导序列、KOZAK序列均符合哺乳动物细胞表达要求，为下一步抗Dc3/抗Dc20双特异性单链抗体的稳定表达及稳定表达细胞株的构建奠定了基础。图2直接竞争ELISA检测目的基因瞬时表达的显色图Al:阴性对照;A2:空白对照;Bl:样品(转染3h6收获的上清);B2:样品(转染2h4收获的上清):Gl:阳性对照表2酶标仪450mn测量的OD值l2A0.000es0


本文编号：3367521