SARS冠状病毒N抗原蛋白表达及血清抗体检测方法研究

发布时间：2021-09-18 12:52

　　目的：表达SARS冠状病毒核壳蛋白，研究建立SARS冠状病毒感染血清学的诊断方法。 方法：构建携带SARS冠状病毒核壳抗原融合蛋白质粒，将表达载体转入大肠杆菌，原核表达His-N融合蛋白，鉴定其免疫原性，利用纯化的重组SARS冠状病毒N蛋白包被微孔板，建立间接ELISA法定性检测人血清中抗SARS冠状病毒IgG抗体的检测方法，进行质量控制，并利用该方法，检测、观察404份SARS患者血清中抗体产生和变化规律。 结果：获得携带SARS冠状病毒核壳抗原基因的pQE-30／N质粒，通过大肠杆菌M15表达体系，在IPTG诱导条件下，可稳定表达融合蛋白His-N。蛋白纯化后经SDS-PAGE电泳，证实经过纯化融合蛋白的纯度达到90％以上，Western blot结果显示：可与确诊的SARS病人的血清特异性结合。以抗原包被浓度0.10μg/孔包被16h，选择1∶4000为酶结合物工作浓度，建立检测血清N蛋白IgG抗体的间接ELISA法。检测正常献血员548份血清标本，确定临界值。将该检测方法与参比试剂进行比较，检测临床确诊和血清学确证86例病人血清标本，对发病15天以上样本检测结果符合... 

【文章来源】：南方医科大学广东省

【文章页数】：51 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

表达载体的鉴定

图2携带SARS冠状病毒核壳(N)抗原基因表达载体图谱N蛋白基因定向克隆于Ba耐I和KPnl位点携带SARS冠状病毒核壳(N)抗原基因表达载体图谱见图2。N蛋白基因定向克隆于BamH工和KPn工位点，从pQE一30/N表达质粒127bp到144bp处，为六组氨酸(6XHIS)的序列，转录翻译融合蛋白;从151bp至1413bp，为N蛋白基因的序列。三、工程菌鉴定(一)PCR鉴定扩增产物得到1263bp基因片断，确定为工程菌含有N蛋白基因。(二)限制性内切酶鉴定培养工程菌，抽提质粒，用BamH工和KPn工酶切，得到基因片断为3450bp和127Obp

用免疫印迹方法鉴定N蛋白的免疫原性，用确诊的SARS病人血清进行检测，在相对分子质量约为47000Da处可见一条单一的蛋白质免疫结合带，结果见图3;用正常人血清进行检测，无蛋白质免疫结合带出现，结果见图4。图3、SARS病人血清与N重组蛋白反应的免疫印迹结果


本文编号：3400172