特异性结合幽门螺杆菌黏附蛋白A（HpaA）核酸适配子的筛选及鉴定
发布时间：2021-10-07 13:30
目的通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选特异性结合幽门螺杆菌（H.pylori）黏附蛋白A（HpaA）的核酸适配子,并鉴定其结合特性。方法构建pET28a/HpaA原核表达质粒并诱导表达纯化重组HpaA蛋白;以重组HpaA蛋白为靶标利用SELEX技术筛选出能够与HpaA具有高特异性、高亲和力结合的核酸适配子。随后利用筛选所得HpaA适配子通过体外实验验证与H.pylori菌体的结合以及对临床胃黏膜切片中H.pylori的检测效能。结果本研究培养并提取ATCC26695菌株基因组,通过PCR扩增HpaA部分基因长度约699 bp,并成功克隆构建了原核表达质粒pET28a/HpaA。经异丙基β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达、纯化获得纯度约98%的重组HpaA蛋白作为筛选靶标。利用SELEX技术通过10轮正向筛选和5轮的负向筛选,获得6条与HpaA高亲和力的适配子分别命名为HA1～HA6。其中适配子HA6具有较高的亲和力和特异性,且适配子HA6核心序列在体外仍表现出与H.pylori菌体较高的结合力;利用羟基荧光素（FAM）标记的HA6适配子对166例H.pylori感染的患...
【文章来源】：细胞与分子免疫学杂志. 2019,35(06)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
HPLC鉴定纯化的重组蛋白HpaA
纯化的重组蛋白HpaA序号肽段序列(N端→C端)相似度1QALDEKILLLＲPAFQYS100%2KEGYLAVAMNGEIVLＲPDPKＲ100%3PDPKＲTIQKKSEPGLLFSTG100%4FVKVTILEPMSG100%5DNSNDAIKS100%2．3适配子的筛选及特性验证合成长度为88个核苷酸的文库，经由10轮的正向筛选和5轮的负向筛选后，分别对收获的10轮文库的相对结合力进行检测。结果显示第1轮到第5轮的相对结合力呈上升趋势，第5轮后负向筛选的加入使得相对结合力暂时下降，但随着筛选轮数的增加其结合力仍呈增高趋势，且高于前5轮(图5)。再将第10轮适配子扩增为双链并克隆进pUC19质粒中，挑选的43个克隆经酶切鉴定其中有40个阳性克隆(图6);将其中结合力相对较高的6个克隆扩增所得适配子编号为HA1～HA6，并使用这6种适配子对5种不同的细菌(大肠杆菌、阴沟杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌、H．pylori)进行特异性鉴定，其中HA6对H．pylori表现出较高的特异性(图7);随后，对这HA6适配子的全长序列和核心序列的ssDNA亲和力进行检测，其KD值分别为:(8．531±1．59)nmol/L和(6．520±1．489)nmol/L(图8)。bP＜0．01vs第10轮．图5不同轮数文库的相对结合力的比较图6限制性内切酶酶切鉴定分析适配子单克隆图7不同单克隆适配子对5种菌株检测性能的比较2．4适配子对Hp感染的诊断效能使用FAM标记的HA6作为检测配基对胃黏膜H．pylori进行检测，在共聚焦显微镜下观察荧光，绿色荧光记为FAM-HA6结合H．pylori菌体，罗丹明标记的H．pylori菌体为红色，合并后呈黄色。本检测的阳性率为94．5
Τ噬仙?魇疲??5轮后负向筛选的加入使得相对结合力暂时下降，但随着筛选轮数的增加其结合力仍呈增高趋势，且高于前5轮(图5)。再将第10轮适配子扩增为双链并克隆进pUC19质粒中，挑选的43个克隆经酶切鉴定其中有40个阳性克隆(图6);将其中结合力相对较高的6个克隆扩增所得适配子编号为HA1～HA6，并使用这6种适配子对5种不同的细菌(大肠杆菌、阴沟杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌、H．pylori)进行特异性鉴定，其中HA6对H．pylori表现出较高的特异性(图7);随后，对这HA6适配子的全长序列和核心序列的ssDNA亲和力进行检测，其KD值分别为:(8．531±1．59)nmol/L和(6．520±1．489)nmol/L(图8)。bP＜0．01vs第10轮．图5不同轮数文库的相对结合力的比较图6限制性内切酶酶切鉴定分析适配子单克隆图7不同单克隆适配子对5种菌株检测性能的比较2．4适配子对Hp感染的诊断效能使用FAM标记的HA6作为检测配基对胃黏膜H．pylori进行检测，在共聚焦显微镜下观察荧光，绿色荧光记为FAM-HA6结合H．pylori菌体，罗丹明标记的H．pylori菌体为红色，合并后呈黄色。本检测的阳性率为94．58%(157/166)，ＲUT阳性率为87．95%(146/166)。与患者的ＲUT结果比对，发现二者检测结果符合率较高，且适配子荧光法高于ＲUT，两种方法差异有统计学意义(P=0．0325，图9)。635细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2019，35(6)
【参考文献】：
期刊论文
[1]血清幽门螺杆菌HpaA抗体与胃癌风险关系的研究[J]. 张冰,李环. 吉林医药学院学报. 2018(06)
[2]抗幽门螺杆菌多价蛋黄液IgY抗体的制备[J]. 孙礼进,张忠宝,曾波,陈咏梅,李浩,周红妹,张智,李再新. 细胞与分子免疫学杂志. 2018(06)
本文编号：3422140
【文章来源】：细胞与分子免疫学杂志. 2019,35(06)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
HPLC鉴定纯化的重组蛋白HpaA
纯化的重组蛋白HpaA序号肽段序列(N端→C端)相似度1QALDEKILLLＲPAFQYS100%2KEGYLAVAMNGEIVLＲPDPKＲ100%3PDPKＲTIQKKSEPGLLFSTG100%4FVKVTILEPMSG100%5DNSNDAIKS100%2．3适配子的筛选及特性验证合成长度为88个核苷酸的文库，经由10轮的正向筛选和5轮的负向筛选后，分别对收获的10轮文库的相对结合力进行检测。结果显示第1轮到第5轮的相对结合力呈上升趋势，第5轮后负向筛选的加入使得相对结合力暂时下降，但随着筛选轮数的增加其结合力仍呈增高趋势，且高于前5轮(图5)。再将第10轮适配子扩增为双链并克隆进pUC19质粒中，挑选的43个克隆经酶切鉴定其中有40个阳性克隆(图6);将其中结合力相对较高的6个克隆扩增所得适配子编号为HA1～HA6，并使用这6种适配子对5种不同的细菌(大肠杆菌、阴沟杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌、H．pylori)进行特异性鉴定，其中HA6对H．pylori表现出较高的特异性(图7);随后，对这HA6适配子的全长序列和核心序列的ssDNA亲和力进行检测，其KD值分别为:(8．531±1．59)nmol/L和(6．520±1．489)nmol/L(图8)。bP＜0．01vs第10轮．图5不同轮数文库的相对结合力的比较图6限制性内切酶酶切鉴定分析适配子单克隆图7不同单克隆适配子对5种菌株检测性能的比较2．4适配子对Hp感染的诊断效能使用FAM标记的HA6作为检测配基对胃黏膜H．pylori进行检测，在共聚焦显微镜下观察荧光，绿色荧光记为FAM-HA6结合H．pylori菌体，罗丹明标记的H．pylori菌体为红色，合并后呈黄色。本检测的阳性率为94．5
Τ噬仙?魇疲??5轮后负向筛选的加入使得相对结合力暂时下降，但随着筛选轮数的增加其结合力仍呈增高趋势，且高于前5轮(图5)。再将第10轮适配子扩增为双链并克隆进pUC19质粒中，挑选的43个克隆经酶切鉴定其中有40个阳性克隆(图6);将其中结合力相对较高的6个克隆扩增所得适配子编号为HA1～HA6，并使用这6种适配子对5种不同的细菌(大肠杆菌、阴沟杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌、H．pylori)进行特异性鉴定，其中HA6对H．pylori表现出较高的特异性(图7);随后，对这HA6适配子的全长序列和核心序列的ssDNA亲和力进行检测，其KD值分别为:(8．531±1．59)nmol/L和(6．520±1．489)nmol/L(图8)。bP＜0．01vs第10轮．图5不同轮数文库的相对结合力的比较图6限制性内切酶酶切鉴定分析适配子单克隆图7不同单克隆适配子对5种菌株检测性能的比较2．4适配子对Hp感染的诊断效能使用FAM标记的HA6作为检测配基对胃黏膜H．pylori进行检测，在共聚焦显微镜下观察荧光，绿色荧光记为FAM-HA6结合H．pylori菌体，罗丹明标记的H．pylori菌体为红色，合并后呈黄色。本检测的阳性率为94．58%(157/166)，ＲUT阳性率为87．95%(146/166)。与患者的ＲUT结果比对，发现二者检测结果符合率较高，且适配子荧光法高于ＲUT，两种方法差异有统计学意义(P=0．0325，图9)。635细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2019，35(6)
【参考文献】：
期刊论文
[1]血清幽门螺杆菌HpaA抗体与胃癌风险关系的研究[J]. 张冰,李环. 吉林医药学院学报. 2018(06)
[2]抗幽门螺杆菌多价蛋黄液IgY抗体的制备[J]. 孙礼进,张忠宝,曾波,陈咏梅,李浩,周红妹,张智,李再新. 细胞与分子免疫学杂志. 2018(06)
本文编号：3422140
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