人源瞬时受体电位M2型通道Nudix水解酶9同源结构域的提取和纯化

发布时间：2021-10-24 05:36

　　目的:摸索人源瞬时受体电位M2型通道（TRPM2）羧基端Nudix水解酶9（NUDT9）同源结构域（NUDT9-H）的蛋白提取和纯化方法。方法:异丙基硫代半乳糖苷诱导表达的Rosetta（DE3）大肠埃希菌菌株经超声破碎和离心后,将收集到的上清液与GST磁珠结合并用还原型谷胱甘肽洗脱以抽提GST-NUDT9-H融合蛋白,浓缩离心后再经分子排阻色谱层析纯化,最后经凝血酶酶切并与GST磁珠结合即得NUDT9-H蛋白。结果:含有0.5%的十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）裂解溶液体系和0.025%的DDM分子排阻层析色谱溶液体系能够提高GST-NUDT9-H融合蛋白的稳定性,再按每2 mg融合蛋白加入1 U凝血酶切割24 h,即获得高纯度NUDT9-H蛋白。结论:NUDT9-H蛋白稳定性较差,提取和纯化体系中需添加DDM以稳定其构象从而提高目的蛋白的产量和纯度。 

【文章来源】：浙江大学学报(医学版). 2019,48(01)北大核心CSCD

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

细菌裂解上清液与GST磁珠重结合可以提高产量FT：流过滤器的上清裂解液；W1：第一次洗涤液；W2：第二次洗涤液；E1：第一次洗脱液；E2：第二次洗脱液.

叶培武，等.人源瞬时受体电位M2型通道Nudix水解酶9同源结构域的提取和纯化层析系统中不含有DDM等能够稳定蛋白的表面活性剂时，融合蛋白在层析过程中仍会发生片段化，因此，层析系统的缓冲液体系需要添加DDM。本实验在含50mmol/LTris、150mmol/L氯化钠且酸碱度为7.4的缓冲液中添加DDM至其终浓度为0.025%。将粗提步骤中洗脱得到的蛋白洗脱液进行浓缩，而后上样过分子筛，收集蛋白峰所对应编号收集管并进行考马斯亮蓝染色法检测。图4可见，蛋白纯化过程中0.025%的DDM就足以促进融合蛋白的稳定，减少25kD左右片段化蛋白的生成。2.5酶切条件摸索结果本实验中纯化蛋白指NUDT9-H与GST标签蛋白的融合蛋白，两者通过凝血酶识别的氨基酸序列连接，然而最终进行功能检测及结构解析所需的蛋白是独立的NUDT9-H。NUDT9-H与GST大小接近，无法排除GST在功能检测和结构解析时对目的蛋白的影响，因此需要用凝血酶切除GST，反向与GST磁珠结合以去除未切割完全的融合蛋白及切下的GST标签蛋白，NUDT9-H片段则在上清液体系中收集，并在280nm波长下初步测定蛋白浓度。根据图4结果，取17、18两管样品，按照1U/2mg或0.5U/2mg蛋白的量加入凝血酶。综合图5A两份样品酶切蛋白的考马斯亮蓝染色结果，根据回收得到30.7kD大小目的蛋白的产率判断，最佳的酶切条件是1U/2mg蛋白的酶量下酶切24h。将剩余融合蛋白峰对应编号的蛋白样本液浓缩后按照前述方法酶切，再与GST磁珠挂住结合后收集上清液，并对各步骤样品制蛋白样进行考马斯亮蓝染色法检测，可得到高纯度的30.7kD目的蛋白NUDT9-H（图5B

细菌裂解上清液与GST磁珠重结合可以提高产量Figure3Re-bindingofthelysatewithregenerativeGSTbeadsleadstohigherproductionoffusionprotein14～20：过分子筛后的蛋白在出峰时由对应编号收集管收集到的蛋白样本.DDM：十二烷基-β-D-麦芽糖苷.图4在纯化缓冲液体系中添加0.025%DDM有助于获得稳定的目的蛋白Figure40.025%DDMinwashbufferstabilizedthefusionproteininpurificationsystemM：标准带；17、18：过分子筛后的蛋白在出峰时电对应编号吸集管收集到的蛋白样.图5融合蛋白酶切时间和浓度优化Figure5Optimizationonthecleavagetimeandconcentrationofthrombin··9


本文编号：3454678