应用CRISPR/Cas9技术制备阿尔茨海默病小鼠模型
发布时间：2021-11-11 21:18
目的敲除α7烟碱型胆碱能受体（α7nAChR）基因构建阿尔茨海默病（AD）小鼠模型,验证成年敲除（KO）鼠是否有AD表征。方法利用CRISPR/Cas9技术,针对α7nAChR基因靶序列设计单链向导RNA（sgRNA）,将sgRNA和Cas9 mRNA显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵。通过检测DNA序列,鉴定和筛选出KO小鼠进行行为学测试。结果 KO鼠α7nAChR基因有531 bp片段敲除;与野生型（WT）组相比,KO组有高架十字迷宫开壁区活动时间短、条件性恐惧表现出僵直时间百分比增高的趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）。结论成功制备AD模型鼠,成年KO鼠学习记忆功能正常,但有焦虑样行为趋势。
【文章来源】：中国老年学杂志. 2019,39(11)北大核心
【文章页数】：4 页
【部分图文】：
sgＲNA序列设计示意图
潭仍降?。水迷宫试验包括定向航行实验及空间探索实验。条件性恐惧反射系统是基于巴普洛夫条件反射而建立的一种经典的诱导焦虑反应模型的方法。动物在恐惧时会表现出特有的僵直不动状态(Freezing)，僵直时间百分比越高，表示越焦虑。1.7统计学方法采用SPSS20．0软件进行t检验、重复测量方差分析。2结果2.1sgＲNA和Cas9体外转录结果根据α7nAChＲ基因intron3和intron4靶序列信息设计sgＲNA，结果显示，体外转录sgＲNA和Cas9成功，电泳图见图2。图2体外转录sgＲNA和Cas9电泳结果2.2F0代小鼠基因型鉴定及扩群繁育阳性F0代小鼠α7nAChＲ基因在第四exon有531bp片段敲除，见图3。选取阳性F0代小鼠与WTC57BL/6J小鼠回交，获得稳定遗传的F1代杂合子，F1自交获得F2代小鼠的PCＲ产物进行基因型鉴定，PCＲ鉴定电泳图见图4。根据结果选取α7nAChＲKO纯合子进行扩繁。2.3行为学测试结果2.3.1旷场试验KO组与WT组运动距离、运动速度、中心区域活动时间差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。图3F0代阳性小鼠基因序列突变陈晓娟等应用CＲISPＲ/Cas9技术制备阿尔茨海默病小鼠模型第11期·3472·
1:纯合子;2:纯合子;3:杂合子;4:杂合子;5:野生型;6:野生型;7:DNAmarker图4F2小鼠基因鉴定电泳表1旷场实验测试结果(x±s)组别n运动距离(cm)运动速度(cm/s)中心区域活动时间(s)WT组126861．1±472．387．62±0．5399．95±7．15KO组136684．37±276．097．42±0．3193．48±8．142.3.2高架十字迷宫试验KO小鼠进入开臂的时间〔(45.24±6.63)s〕少于WT小鼠〔(53.63±7.94)s〕，但差异无统计学意义(P＞0.05)。2.3.3水迷宫试验KO组与WT组在定向航行实验和空间探索实验无统计学差异(P＞0.05)，见表2。表2水迷宫测试结果(x±s，s)组别n定向航行试验第1天第2天第3天第4天第5天空间探索实验WT组1247．21±2．3127．26±3．5424．84±3．0517．98±2．4816．08±1．8830．64±2．12KO组1349．13±1．9332．03±2．5827．36±2．0719．28±2．4916．24±1．7029．73±1．732.3.4条件性恐惧反射系统试验KO组僵直时间百分比高于WT组，但差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。表3条件性恐惧记忆测试结果(x±s，%)组别n场景恐惧记忆水平声音恐惧记忆水平WT组1231．29±3．0650．78±6．20KO组1337．88±5．0560．03±6．033讨论AD主要病理特征是神经元外周β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积引发的炎性斑点〔10〕。研究证实，AD患者胆碱能神经元明显减少，且α7nAChＲ在大脑皮质和海马部位显著下降。Aβ拮抗α7nAChＲ引起的细胞毒性可以用α7nAChＲ激动剂缓解〔11〕。临床试验证明，α7nAC
【参考文献】：
期刊论文
[1]Effects of medicinal plants on Alzheimer’s disease and memory deficits[J]. Muhammad Akram,Allah Nawaz. Neural Regeneration Research. 2017(04)
[2]阿尔茨海默病患者家庭照料者生活质量及其影响因素[J]. 胡舒,谭小林,赵科,文宴,黄杰,陈非,蒋平静,蒋振虹. 中国老年学杂志. 2017(07)
[3]帕金森病小鼠模型行为学检测方法的比较研究[J]. 姚庆和,张华,高国栋. 中国实验动物学报. 2006(04)
[4]BALB/c和C57BL/6小鼠在基因功能检测中行为学的比较研究[J]. 金玫蕾,刘留,郭宁,莫韫,谢青莲,李葆明,赵国屏,景乃禾. 中国实验动物学报. 2001(01)
本文编号：3489540
【文章来源】：中国老年学杂志. 2019,39(11)北大核心
【文章页数】：4 页
【部分图文】：
sgＲNA序列设计示意图
潭仍降?。水迷宫试验包括定向航行实验及空间探索实验。条件性恐惧反射系统是基于巴普洛夫条件反射而建立的一种经典的诱导焦虑反应模型的方法。动物在恐惧时会表现出特有的僵直不动状态(Freezing)，僵直时间百分比越高，表示越焦虑。1.7统计学方法采用SPSS20．0软件进行t检验、重复测量方差分析。2结果2.1sgＲNA和Cas9体外转录结果根据α7nAChＲ基因intron3和intron4靶序列信息设计sgＲNA，结果显示，体外转录sgＲNA和Cas9成功，电泳图见图2。图2体外转录sgＲNA和Cas9电泳结果2.2F0代小鼠基因型鉴定及扩群繁育阳性F0代小鼠α7nAChＲ基因在第四exon有531bp片段敲除，见图3。选取阳性F0代小鼠与WTC57BL/6J小鼠回交，获得稳定遗传的F1代杂合子，F1自交获得F2代小鼠的PCＲ产物进行基因型鉴定，PCＲ鉴定电泳图见图4。根据结果选取α7nAChＲKO纯合子进行扩繁。2.3行为学测试结果2.3.1旷场试验KO组与WT组运动距离、运动速度、中心区域活动时间差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。图3F0代阳性小鼠基因序列突变陈晓娟等应用CＲISPＲ/Cas9技术制备阿尔茨海默病小鼠模型第11期·3472·
1:纯合子;2:纯合子;3:杂合子;4:杂合子;5:野生型;6:野生型;7:DNAmarker图4F2小鼠基因鉴定电泳表1旷场实验测试结果(x±s)组别n运动距离(cm)运动速度(cm/s)中心区域活动时间(s)WT组126861．1±472．387．62±0．5399．95±7．15KO组136684．37±276．097．42±0．3193．48±8．142.3.2高架十字迷宫试验KO小鼠进入开臂的时间〔(45.24±6.63)s〕少于WT小鼠〔(53.63±7.94)s〕，但差异无统计学意义(P＞0.05)。2.3.3水迷宫试验KO组与WT组在定向航行实验和空间探索实验无统计学差异(P＞0.05)，见表2。表2水迷宫测试结果(x±s，s)组别n定向航行试验第1天第2天第3天第4天第5天空间探索实验WT组1247．21±2．3127．26±3．5424．84±3．0517．98±2．4816．08±1．8830．64±2．12KO组1349．13±1．9332．03±2．5827．36±2．0719．28±2．4916．24±1．7029．73±1．732.3.4条件性恐惧反射系统试验KO组僵直时间百分比高于WT组，但差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。表3条件性恐惧记忆测试结果(x±s，%)组别n场景恐惧记忆水平声音恐惧记忆水平WT组1231．29±3．0650．78±6．20KO组1337．88±5．0560．03±6．033讨论AD主要病理特征是神经元外周β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积引发的炎性斑点〔10〕。研究证实，AD患者胆碱能神经元明显减少，且α7nAChＲ在大脑皮质和海马部位显著下降。Aβ拮抗α7nAChＲ引起的细胞毒性可以用α7nAChＲ激动剂缓解〔11〕。临床试验证明，α7nAC
【参考文献】：
期刊论文
[1]Effects of medicinal plants on Alzheimer’s disease and memory deficits[J]. Muhammad Akram,Allah Nawaz. Neural Regeneration Research. 2017(04)
[2]阿尔茨海默病患者家庭照料者生活质量及其影响因素[J]. 胡舒,谭小林,赵科,文宴,黄杰,陈非,蒋平静,蒋振虹. 中国老年学杂志. 2017(07)
[3]帕金森病小鼠模型行为学检测方法的比较研究[J]. 姚庆和,张华,高国栋. 中国实验动物学报. 2006(04)
[4]BALB/c和C57BL/6小鼠在基因功能检测中行为学的比较研究[J]. 金玫蕾,刘留,郭宁,莫韫,谢青莲,李葆明,赵国屏,景乃禾. 中国实验动物学报. 2001(01)
本文编号：3489540
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