强啡肽对脊髓cNOS与iNOS活性、分布和基因表达的影响及机制

发布时间：2021-12-19 08:34

　　强啡肽A_1-17(DynorphinA_1-17，Dyn)是内源性_κ受体激动剂，蛛网膜下腔注射（Intrathecal Injection，i．t．）后产生强烈的镇痛作用，但大剂量时常伴一过性或持久性双下肢和尾部瘫痪。在外周神经病痛和脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI）后内源性Dyn含量和基因表达均明显升高，提示Dyn与镇痛或痛调制及脊髓继发损伤机制有关。但Dyn致SCI与镇痛作用的机制尚不清楚。一氧化氮（Nitric Oxide，NO）和c-fos具有广泛而复杂的生理与病理作用，近几年受到普遍关注。为了阐明cNOS和iNOS在Dyn致SCI（腹角）和镇痛（背角）中的不同作用及其与NMDA受体、Ca²⁺和c-fos间的相互关系，为SCI、阿片肽和NO的理论研究及临床应用提供依据，本论文采用组化、免疫组化和原位杂交技术观测Dyn致SCI和镇痛过程中NADPH-d活性、bcNOS与iNOS及c-fos免疫活性（IR）和mRNA表达的改变，采用³H-L-Arg转化和... 

【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：149 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
1 英文缩略词
2 中文摘要
3 英文摘要
4 前言
5 材料与方法
    5.1 药品与试剂
    5.2 动物、手术和药物引入
    5.3 后肢运动功能测定
    5.4 痛敏行为观察
    5.5 热辐射甩尾潜伏期(TFL)和缩腿潜伏期(FFL)测定
    5.6 大鼠Formalin致痛模型
    5.7 脊髓原代细胞培养
        5.7.1 孕鼠胎龄判定
        5.7.2 鼠尾胶原制备
        5.7.3 鼠尾胶原和多聚赖氨酸双层铺板
        5.7.4 培养方法
    5.8 培养神经细胞的损伤程度判定
        5.8.1 形态观察
        5.8.2 LDH测定
        5.8.3 细胞死亡率
        5.8.4 NO测定(Griess法)
    5.9 显微荧光光度技术测定脊髓神经元单细胞内游离钙离子浓度([Ca~(2+)]i)
    5.10 cNOS和iNOS活性测定
        5.10.1 取材与冻存
        5.10.2 ~3H-L-Arg转化实验
    5.11 脊髓膜制备与~3H-MK801结合实验
    5.12 神经形态学研究方法
        5.12.1 灌注固定、取材与切片
        5.12.2 尼氏体染色
        5.12.3 NADPH-d组化染色
        5.12.4 免疫组织(细胞)化学ABC反应法
    5.13 分子生物学方法
        5.13.1 bcNOS、iNOS和c-fos质粒cDNA的扩增和提取
            5.13.1.1 感受态细胞的制备
            5.13.1.2 质粒转化、克隆与扩增
            5.13.1.3 质粒DNA小量提取
            5.13.1.4 质粒DNA中量提取与纯化
            5.13.1.5 酶切鉴定
        5.13.2 bcNOS、iNOS和c-fos探针制备与特异性鉴定
            5.13.2.1 bcNOS、iNOS和c-fos相互独立(特异)的探针选择
            5.13.2.2 探针的回收
        5.13.3 探针标记与检测
        5.13.4 斑点杂交
        5.13.5 原位杂交
            5.13.5.1 主要溶液配制
            5.13.5.2 漂浮法原位杂交基本程序
            5.13.5.3 实验对照与条件控制
    5.14 半定量分析
    5.15 统计学方法
6 结果
    6.1 Dyn致瘫后cNOS和iNOS活性与mRNA表达。
        6.1.1 不同剂量Dyn对大鼠脊髓功能和病理的影响。
        6.1.2 Dyn致瘫后不同时间背侧与腹侧脊髓cNOS和iNOS活性变化。
        6.1.3 Dyn致瘫后NADPH-d变化
        6.1.4 Dyn致瘫后bcNOS和iNOS免疫活性变化
        6.1.5 bcNOS-IR与NADPH-d活性变化的比较
        6.1.6 致瘫剂量Dyn对bcNOS和iNOS mRNA表达的影响
            6.1.6.1 方法鉴定
            6.1.6.2 bcNOSmRNA表达的细胞定位与损伤反应
            6.1.6.3 iNOSmRNA表达的细胞定位和损伤反应
        6.1.7 小结
    6.2 NOS抑制剂L-NAME,7-NI和AG对Dyn致瘫和镇痛作用的影响
        6.2.1 功能对抗与病理改善
            6.2.1.1 对ecNOS和bcNOS无选择性的cNOS抑制剂L-NAME
            6.2.1.2 iNOS选择性抑制剂AG
            6.2.1.3 bcNOS选择性抑制7-NI
        6.2.2 背侧与腹侧脊髓cNOS和iNOS活性变化
        6.2.3 NADPH-d活性与bcNOS免疫活性变化
        6.2.4 小结
    6.3 NOS底物L-Arg和NO供体Sper／NO对Dyn致瘫和镇痛作用的影响
        6.3.1 功能与病理变化
            6.3.1.1 L-Arg低剂量镇痛和高剂量致痛
            6.3.1.2 Sper／NO低剂量对抗Dyn致瘫和加强镇痛,高剂量本身致瘫和致痛
        6.3.2 背侧与腹侧脊髓cNOS和iNOS活性和MK801结合的变化
        6.3.3 小结
    6.4 Dyn致瘫和镇痛时NOS表达与NMDA和_κ受体的相互关系)
        6.4.1 Dyn致瘫和镇痛时NMDA受体活性与NOS表达的相互关系
        6.4.2 _κ受体参与Dyn致瘫引起的NOS表达增强
        6.4.3 小结
    6.5 Dyn致瘫和镇痛时NOS与c-fos表达的相互关系
        6.5.1 c-Fos免疫组化的最佳条件与正常分布
        6.5.2 Dyn致瘫早期c-Fos-IR表达明显落后于bcNOS-IR,但后期c-Fos-IR和bcNOS-IR均持续性表达,并与病理损害和功能障碍密切相关。
        6.5.3 镇痛剂量Dyn可明显抑制Formalin诱发的c-Fos-IR和bcNOS-IR表达,并被Nor-BNI所对抗
        6.5.4 镇痛剂量Dyn可明显抑制Formalin诱发的c-fos、bcNOS和iNOSmRNA表达,并被Nor-BNI对抗
        6.5.5 NOS与c-fos之间的跨细胞信息传递
        6.5.6.小结
    6.6 Dyn通过_κ和NMDA受体影响单细胞内游离Ca~(2+)浓度
        6.6.1 Dyn对去极化性[Ca2+]i的抑制和促进作用
        6.6.2 NMDA和_κ受体机制
        6.6.3 小结
    6.7 离体培养脊髓神经元的NMDA和Dyn毒性
        6.7.1 离体培养脊髓神经元NMDA的毒性和NO介导机制
        6.7.2 DynA(1-17)对培养脊髓神经元的影响
        6.7.3 小结
7 讨论
    7.1 腹侧和背侧脊髓NOS变化与Dyn致瘫和镇痛作用
    7.2 bcNOS与iNOS在Dyn致脊髓损伤中的不同作用
    7.3 Dyn致脊髓损伤后bcNOS和iNOS的细胞来源
    7.4 bcNOS和iNOS引起神经损伤的机制
    7.5 Dyn诱发腹侧脊髓bcNOS和iNOS高表达的机制
    7.6 NMDA-NOS／NO与Dyn镇痛(痛调制)
    7.7 NO的血管作用与细胞作用
    7.8 Dyn致瘫的缺血机制与细胞毒性机制
    7.9 脊髓表达多种基因的共性分析与意义
    7.10 Dyn致脊髓损伤后iNOSmRNA表达而iNOS-IR阴性的原因分析
    7.11 bcNOS神经元的自身保护与自身灭亡
8 结论
9 致谢
10 参考文献
11 综述一：NO在神经损伤中的保护与毒性作用
    11.1 NO简况
    11.2 NO的神经毒性与保护作用
    11.3 NO的神经保护机制
    11.4 NO的神经毒性机制
    11.5 参考文献
12 综述二：强啡肽痛调制和致神经损伤作用的研究进展
    12.1 Dyn镇痛与致痛作用及其机制
    12.2 Dyn致神经损伤作用及其机制
    12.3 参考文献
13 攻读博士学位期间发表的论文
14 个人简历
15 导师组成员



本文编号：3544103