酵母双杂交技术筛选与STING蛋白相互作用的蛋白
发布时间：2022-01-08 18:43
目的应用酵母双杂交技术筛选出与干扰素刺激因子（stimulator of IFN genes,STING）相作用的分子,为深入研究STING蛋白的分子水平的功能奠定基础。方法利用基因克隆的方法构建酵母双杂交质粒pGBKT7-STING。应用酵母杂交技术从人胚肾cDNA库中筛选出与STING蛋白相互作用的蛋白,并在酵母中从新验证其相互作用。结果应用酵母双杂交系统筛选出与STING蛋白相作用的19个候选分子,成功构建pGBKT7-STING质粒,且可以在酵母中表达。结论应用酵母双杂交技术可筛选出与STING蛋白相互作用蛋白。
【文章来源】：牡丹江医学院学报. 2019,40(03)
【文章页数】：4 页
【部分图文】：
STING蛋白琼脂糖凝胶电泳分析A:STING蛋白的PCＲ产物电泳图;B:pGBKT7－STING双酶切后电泳图
?炕?⒎直鹩?KpnI和XhoI连接，并与相同的pGBKT7载体连接。筛选阳性克隆，通过KpnI和XhoI消化如图1所示和DNA测序分析鉴定阳性克隆。Blast比对完全正确。图1STING蛋白琼脂糖凝胶电泳分析A:STING蛋白的PCＲ产物电泳图;B:pGBKT7－STING双酶切后电泳图2．2诱导蛋白在酵母细胞中STING蛋白的表达将pGBKT7和pGBKT7－STING分别转染到酵母细胞中。扩增培养物，将细胞裂解提取酵母蛋白，利用免疫印迹检测酵母细胞中STING蛋白的表达。结果如图2所示，pGBKT7－STING在对应位置出现条带。图2诱饵质粒pGBKT7－STING在酵母中的表达2．3PCＲ阳性克隆将含有诱饵质粒pGBKT7－STING的酵母与人胚肾cDNA库融合在QDO/X/A皿上选择蓝色克隆进行大量筛选。获取酵母质粒并使用酵母F－T7，Ｒ－3＇AD作为引物利用PCＲ鉴定。将具有阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌中。获得。一共挑取了242个克隆进行PCＲ鉴定，其中19个是非重复且有意义的阳性克隆，如图3所示。图3PCＲ鉴定阳性克隆质粒M:Marker;1－19:PCＲ产物2．4在酵母体内监测STING蛋白与候选分子的相互作用本实验将pGBKT7－STING和pGBKT7－junB一起转化到酵母Y2H感受态细胞，按不同浓度梯度涂于SD/－Trp－Leu－His－Ade/X－α－GAL/AbA平板，诱饵质粒在不同培养基上的生长结果如图4所示，出现蓝色菌落。我们发现不同浓度的菌落颜色深浅有差异，菌落大小也存在差异，这提示候选分子与酵母中的STING蛋白之间一定的作用关系。图4酵母双杂交筛选与STING蛋白在酵母中存在相?
??STING蛋白的表达。结果如图2所示，pGBKT7－STING在对应位置出现条带。图2诱饵质粒pGBKT7－STING在酵母中的表达2．3PCＲ阳性克隆将含有诱饵质粒pGBKT7－STING的酵母与人胚肾cDNA库融合在QDO/X/A皿上选择蓝色克隆进行大量筛选。获取酵母质粒并使用酵母F－T7，Ｒ－3＇AD作为引物利用PCＲ鉴定。将具有阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌中。获得。一共挑取了242个克隆进行PCＲ鉴定，其中19个是非重复且有意义的阳性克隆，如图3所示。图3PCＲ鉴定阳性克隆质粒M:Marker;1－19:PCＲ产物2．4在酵母体内监测STING蛋白与候选分子的相互作用本实验将pGBKT7－STING和pGBKT7－junB一起转化到酵母Y2H感受态细胞，按不同浓度梯度涂于SD/－Trp－Leu－His－Ade/X－α－GAL/AbA平板，诱饵质粒在不同培养基上的生长结果如图4所示，出现蓝色菌落。我们发现不同浓度的菌落颜色深浅有差异，菌落大小也存在差异，这提示候选分子与酵母中的STING蛋白之间一定的作用关系。图4酵母双杂交筛选与STING蛋白在酵母中存在相互作用的候选分子3讨论为进一步研究STING蛋白对先天免疫应答过程的调节作用，本研究以STING为诱饵蛋白，通过酵母双杂交方法从人胚胎肾cDNA文库中筛选出与STING蛋白相互作用的候选分子。为了寻找与STING蛋白有相互作用的候选分子，本研究首先设计特异性引物，构建诱饵质粒GBKT7－STING。再将重组质粒GBKT7－STING转化酵母Y2H感受态细胞，应用此诱饵质粒进行酵母双杂交，用来筛选与STING蛋白存在相互作用的候选分子。将诱饵质粒GBKT7－S
【参考文献】：
期刊论文
[1]Innate recognition of microbial-derived signals in immunity and inflammation[J]. Yue Zhang,Chunli Liang. Science China（Life Sciences）. 2016(12)
本文编号：3577082
【文章来源】：牡丹江医学院学报. 2019,40(03)
【文章页数】：4 页
【部分图文】：
STING蛋白琼脂糖凝胶电泳分析A:STING蛋白的PCＲ产物电泳图;B:pGBKT7－STING双酶切后电泳图
?炕?⒎直鹩?KpnI和XhoI连接，并与相同的pGBKT7载体连接。筛选阳性克隆，通过KpnI和XhoI消化如图1所示和DNA测序分析鉴定阳性克隆。Blast比对完全正确。图1STING蛋白琼脂糖凝胶电泳分析A:STING蛋白的PCＲ产物电泳图;B:pGBKT7－STING双酶切后电泳图2．2诱导蛋白在酵母细胞中STING蛋白的表达将pGBKT7和pGBKT7－STING分别转染到酵母细胞中。扩增培养物，将细胞裂解提取酵母蛋白，利用免疫印迹检测酵母细胞中STING蛋白的表达。结果如图2所示，pGBKT7－STING在对应位置出现条带。图2诱饵质粒pGBKT7－STING在酵母中的表达2．3PCＲ阳性克隆将含有诱饵质粒pGBKT7－STING的酵母与人胚肾cDNA库融合在QDO/X/A皿上选择蓝色克隆进行大量筛选。获取酵母质粒并使用酵母F－T7，Ｒ－3＇AD作为引物利用PCＲ鉴定。将具有阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌中。获得。一共挑取了242个克隆进行PCＲ鉴定，其中19个是非重复且有意义的阳性克隆，如图3所示。图3PCＲ鉴定阳性克隆质粒M:Marker;1－19:PCＲ产物2．4在酵母体内监测STING蛋白与候选分子的相互作用本实验将pGBKT7－STING和pGBKT7－junB一起转化到酵母Y2H感受态细胞，按不同浓度梯度涂于SD/－Trp－Leu－His－Ade/X－α－GAL/AbA平板，诱饵质粒在不同培养基上的生长结果如图4所示，出现蓝色菌落。我们发现不同浓度的菌落颜色深浅有差异，菌落大小也存在差异，这提示候选分子与酵母中的STING蛋白之间一定的作用关系。图4酵母双杂交筛选与STING蛋白在酵母中存在相?
??STING蛋白的表达。结果如图2所示，pGBKT7－STING在对应位置出现条带。图2诱饵质粒pGBKT7－STING在酵母中的表达2．3PCＲ阳性克隆将含有诱饵质粒pGBKT7－STING的酵母与人胚肾cDNA库融合在QDO/X/A皿上选择蓝色克隆进行大量筛选。获取酵母质粒并使用酵母F－T7，Ｒ－3＇AD作为引物利用PCＲ鉴定。将具有阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌中。获得。一共挑取了242个克隆进行PCＲ鉴定，其中19个是非重复且有意义的阳性克隆，如图3所示。图3PCＲ鉴定阳性克隆质粒M:Marker;1－19:PCＲ产物2．4在酵母体内监测STING蛋白与候选分子的相互作用本实验将pGBKT7－STING和pGBKT7－junB一起转化到酵母Y2H感受态细胞，按不同浓度梯度涂于SD/－Trp－Leu－His－Ade/X－α－GAL/AbA平板，诱饵质粒在不同培养基上的生长结果如图4所示，出现蓝色菌落。我们发现不同浓度的菌落颜色深浅有差异，菌落大小也存在差异，这提示候选分子与酵母中的STING蛋白之间一定的作用关系。图4酵母双杂交筛选与STING蛋白在酵母中存在相互作用的候选分子3讨论为进一步研究STING蛋白对先天免疫应答过程的调节作用，本研究以STING为诱饵蛋白，通过酵母双杂交方法从人胚胎肾cDNA文库中筛选出与STING蛋白相互作用的候选分子。为了寻找与STING蛋白有相互作用的候选分子，本研究首先设计特异性引物，构建诱饵质粒GBKT7－STING。再将重组质粒GBKT7－STING转化酵母Y2H感受态细胞，应用此诱饵质粒进行酵母双杂交，用来筛选与STING蛋白存在相互作用的候选分子。将诱饵质粒GBKT7－S
【参考文献】：
期刊论文
[1]Innate recognition of microbial-derived signals in immunity and inflammation[J]. Yue Zhang,Chunli Liang. Science China（Life Sciences）. 2016(12)
本文编号：3577082
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