人可溶性CD14检测体系的建立及应用研究

发布时间：2022-01-22 11:21

　　可溶性CD14检测体系的建立及其应用研究 CD14是革兰氏阴性菌内毒素脂多糖（LPS）的高亲和力受体之一。除LPS外，CD14还介导肽聚糖（PGN）、脂磷壁酸（LTA）、脂蛋白等多种病原体成分与细胞的反应，它是天然免疫中重要的模式识别分子。CD14有两种存在形式：细胞膜表面的膜型受体（mCD14）和可溶性受体（sCD14）。sCD14存在于人体血液，脑脊液等体液中，在感染、创伤、烧伤和SLE等多种疾病中，sCD14的水平会升高，且与疾病的发生、发展相关。目前sCD14已成为机体单核／巨噬细胞活化的标志，用于监测疾病的发生和发展。 国内关于sCD14的研究极少，究其原因，与目前尚无国产试剂盒而国外进口试剂盒价格昂贵有关。为解决这一困难，推动该领域的研究，并为国内关于CD14的基础研究和临床研究提供技术支持，本研究建立了人sCD14单多抗双夹心ELISA检测体系；同时，还从人血浆中提取了天然sCD14，并进行了人CD14基因的克隆和表达，为在后续工作能深入研究CD14的生物学功能，探讨CD14与Toll样受体的相互作用以及在抗感染免疫中发挥的作用奠定了必要的基础。 一、建... 

【文章来源】：南方医科大学广东省

【文章页数】：92 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

一人THPI一CD14细胞总RNAFig.2召To扭1RNAfromTHPI一CD14图2一RT一PCR扩增人CD14全长基因Fig·2礴DNAseg皿entsofhumanCD14byRT一PCR

3:Clone4digestodbyEeoIU&Xbal4:Clone5digestodbyEeoRI&Xbal图2一7重组载体pUCmTzeDi4的单酶切鉴定Fig.2一7ldentineationofPUCmT/CD14byEeoRIl:MarkerDL150002:Clone2digestedbyEeoRI3:Clone4digestedbyEeoRI4:Clone5digestedbyEeoRI四、构建重组人CD14原核表达载体将构建的重组pET28b/cD14质粒转化T叩一10F’感受态细胞后，挑取单菌落，提取质粒进行PCR和酶切鉴定。如图2一8，PCR鉴定扩增出约1000bp的基因片断，用BamHI和EcoRI双酶切也出现了约1000bp的基因片断(图2一9)，均与预期结果一致。对该阳性克隆进行测序鉴定，证明本实验成功构建了pET28b/cD14原核表达载体，目的基因插入表达载体中，读码框正确。

l:MafkerDL20002:PCRProductofPET28b/CD14图2一9Bamm&Ec。班双酶切鉴定重组PET28blCD14质粒Fig.2一9Iden成eationofPET28b/CD14byBamm&Eeoml:MarkerDL20002:PET28b/CD14digestedbyBamHI&ECORI五、SDS一pAGE鉴定reDi4原核表达蛋白重组pET28b/CD14质粒转化BL21(DE3)表达菌，经过IPTo诱导表达后，与空载体对照和诱导前表达菌对照相比，表达菌经诱导后在66kDa和43kDa之间出现了较明显的表达蛋白，蛋白分子量与预期一致(图2一10)。六、分析重组蛋白在大肠杆菌中的分布和存在形式及Westernblot鉴定如图2一11cD14重组蛋白是以包涵体形式存在，表达菌超声后上清中没有可溶性重组蛋白，Westemblot结果证明重组蛋白能够与小鼠抗人CD14单抗60bca特异性结合。

【参考文献】：
期刊论文
[1]动态观察急性脑血管病患者血浆肿瘤坏死因子-α含量变化的临床意义[J]. 毕国荣,卢丽萍,剑非.  临床神经病学杂志. 1999(02)



本文编号：3602105