汉滩病毒核衣壳蛋白与宿主相互作用蛋白的分离与纯化
发布时间：2022-01-23 03:28
目的构建带有亲和素标签的汉滩病毒（HTNV）核衣壳蛋白（NP）表达质粒,转染HEK293T细胞并表达后,鉴定与其相互作用的宿主蛋白。方法合成亲和素标签基因（SF）与HTNV NP基因,先后克隆入哺乳动物真核表达载体pCAGGS,构建带有亲和标签SF的HTNV NP表达质粒,酶切鉴定重组质粒,获得的重组质粒命名为pCAGGS-SF-NP。将重组表达质粒瞬时转染到HEK293T细胞中, Western blot法检测重组质粒的表达;瞬时转染并收获蛋白样品,与StrepTrapTM HP琼脂珠混匀后, 4℃过夜孵育;转移到层析柱中,经缓冲液洗涤、脱硫生物素洗脱完成亲和层析,获得洗脱样本;洗脱样品进行SDS-PAGE,分离得到与NP相互作用的宿主蛋白。结果酶切鉴定结果表明成功构建pCAGGS-SF和pCAGGS-SF-NP,重组质粒成功表达串联SF与NP的融合蛋白;在亲和层析过程中,成功特异富集融合蛋白SF-NP;洗脱样品成功分离出与NP相互作用的宿主蛋白。结论构建的重组表达质粒可以在真核细胞中成功表达融合蛋白SF-NP并获得了与NP相互作用的宿主蛋白。
【文章来源】：细胞与分子免疫学杂志. 2019,35(02)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
图1双酶切鉴定pCAGGS-SF载体的琼脂糖凝胶电泳结果M:DNAmarker;1
余浓缩洗脱液样本进行SDS-PAGE，经考马斯亮蓝染色后观察蛋白条带。2结果2．1重组载体的酶切鉴定用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定基因SF与载体pCAGGS的连接产物，电泳结果显示在5000bp及250bp左右分别出现特异条带，与预期条带大小相符(SF基因约为240bp)，证明pCAGGS-SF连接成功(图1)。随后将NP基因与pCAGGS-SF进行连接，用EcoＲⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定，电泳结果显示在1500bp左右出现特异条带，与SF-NP大小相符，证明pCAGGS-SF-NP质粒构建成功(图2)。M:DNAmarker;1、2:KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定产物．图1双酶切鉴定pCAGGS-SF载体的琼脂糖凝胶电泳结果M:DNAmarker;1、2:EcoＲⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定产物．图2双酶切鉴定pCAGGS-SF-NP载体的琼脂糖凝胶电泳结果2．2NP融合蛋白的Westernblot鉴定Westernblot法鉴定pCAGGS-SF-NP质粒在HEK293T细胞中的表达情况(图3)。实验结果表明NP组在Mr60000附近分别有一条蛋白条带，与SF-NP大小一致，而对照组即空载体(Vec)组并没有相应条带，证明pCAGGS-SF-NP质粒在HEK293T细胞中表达成功。A:小鼠抗NPmAb1A8;B:兔抗FLAGpAb;C:小鼠抗StrepmAb．M:蛋白Mrmarker;NP组:转染pCAGGS-SF-NP;Vec组:转染pCAGGS-SF．图3Westernblot法鉴定pCAGGS-SF-NP转染HEK293T细胞裂解液的结果2．3与NP相互作用蛋白的亲和纯化对HEK293T细胞裂解液进行亲和层析，从而获得了高浓度的目的蛋白。在亲和层析的过程中，留取了每一步的液体，检测其蛋白浓度并进行Westernblo
GGS-SF-NP载体的琼脂糖凝胶电泳结果2．2NP融合蛋白的Westernblot鉴定Westernblot法鉴定pCAGGS-SF-NP质粒在HEK293T细胞中的表达情况(图3)。实验结果表明NP组在Mr60000附近分别有一条蛋白条带，与SF-NP大小一致，而对照组即空载体(Vec)组并没有相应条带，证明pCAGGS-SF-NP质粒在HEK293T细胞中表达成功。A:小鼠抗NPmAb1A8;B:兔抗FLAGpAb;C:小鼠抗StrepmAb．M:蛋白Mrmarker;NP组:转染pCAGGS-SF-NP;Vec组:转染pCAGGS-SF．图3Westernblot法鉴定pCAGGS-SF-NP转染HEK293T细胞裂解液的结果2．3与NP相互作用蛋白的亲和纯化对HEK293T细胞裂解液进行亲和层析，从而获得了高浓度的目的蛋白。在亲和层析的过程中，留取了每一步的液体，检测其蛋白浓度并进行Westernblot分析(图4)。pCAGGS-SF组和pCAGGS-SF-NP组流洗液中的蛋白浓度随着洗涤次数的增加而降低，最终在第5次洗涤后接近于零，说明与琼脂珠非特异结合的蛋白已基本去除(图4A)。在洗脱过程中，随着脱硫生物素的加入，在图中箭头处，pCAGGS-SF-NP组样本中可以看到一个峰值，说明特异性与琼脂珠结合的融合蛋白SF-NP被竞争脱落，经超滤后获得的样本即仅含SF-NP及其相互作用蛋白。Westernblot结果显示(图4B)，在裂解液和洗脱液的泳道中，均在相对分子质量(Mr)60000左右处出现一条蛋白条带，而流洗液中并未出现，表明洗涤过程充分去除了非特异结合蛋白;同时可以看到，洗脱液泳道中蛋白条带明显粗于裂解液泳道的蛋白条带，表明亲和层析过程富集SF-NP的效果非常明显。收获的样品SDS-PAGE后经
【参考文献】：
期刊论文
[1]连续性肾替代疗法在重症肾综合征出血热患者中的临床治疗效果[J]. 陈天月,张学峰,孟晨鑫. 黑龙江医药. 2018(05)
[2]东南沿海地区1980-2015年汉坦病毒分子特征及流行病学分析[J]. 黄鹏,杨章女,刘源,姚苹苹,胡建利,王笑辰,俞建家,李军,韩亚萍,金柯,杨龙,张云,岳明. 中国媒介生物学及控制杂志. 2017(04)
[3]Hantavirus infection:a global zoonotic challenge[J]. Hong Jiang,Xuyang Zheng,Limei Wang,Hong Du,Pingzhong Wang,Xuefan Bai. Virologica Sinica. 2017(01)
[4]2型登革病毒非结构蛋白NS3的表达及其相互作用蛋白的纯化[J]. 翁代慧,雷迎峰,董阳超,韩佩君,叶传涛,杨敬,王媛,尹文. 细胞与分子免疫学杂志. 2015(12)
博士论文
[1]我国南方地区蝙蝠汉坦病毒的分子流行病学与血清学研究[D]. 徐琳.军事科学院 2018
硕士论文
[1]lncRNA NEAT1调控宿主抗汉滩病毒固有免疫应答分子机制的初步研究[D]. 马宏炜.第四军医大学 2017
本文编号：3603506
【文章来源】：细胞与分子免疫学杂志. 2019,35(02)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
图1双酶切鉴定pCAGGS-SF载体的琼脂糖凝胶电泳结果M:DNAmarker;1
余浓缩洗脱液样本进行SDS-PAGE，经考马斯亮蓝染色后观察蛋白条带。2结果2．1重组载体的酶切鉴定用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定基因SF与载体pCAGGS的连接产物，电泳结果显示在5000bp及250bp左右分别出现特异条带，与预期条带大小相符(SF基因约为240bp)，证明pCAGGS-SF连接成功(图1)。随后将NP基因与pCAGGS-SF进行连接，用EcoＲⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定，电泳结果显示在1500bp左右出现特异条带，与SF-NP大小相符，证明pCAGGS-SF-NP质粒构建成功(图2)。M:DNAmarker;1、2:KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定产物．图1双酶切鉴定pCAGGS-SF载体的琼脂糖凝胶电泳结果M:DNAmarker;1、2:EcoＲⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定产物．图2双酶切鉴定pCAGGS-SF-NP载体的琼脂糖凝胶电泳结果2．2NP融合蛋白的Westernblot鉴定Westernblot法鉴定pCAGGS-SF-NP质粒在HEK293T细胞中的表达情况(图3)。实验结果表明NP组在Mr60000附近分别有一条蛋白条带，与SF-NP大小一致，而对照组即空载体(Vec)组并没有相应条带，证明pCAGGS-SF-NP质粒在HEK293T细胞中表达成功。A:小鼠抗NPmAb1A8;B:兔抗FLAGpAb;C:小鼠抗StrepmAb．M:蛋白Mrmarker;NP组:转染pCAGGS-SF-NP;Vec组:转染pCAGGS-SF．图3Westernblot法鉴定pCAGGS-SF-NP转染HEK293T细胞裂解液的结果2．3与NP相互作用蛋白的亲和纯化对HEK293T细胞裂解液进行亲和层析，从而获得了高浓度的目的蛋白。在亲和层析的过程中，留取了每一步的液体，检测其蛋白浓度并进行Westernblo
GGS-SF-NP载体的琼脂糖凝胶电泳结果2．2NP融合蛋白的Westernblot鉴定Westernblot法鉴定pCAGGS-SF-NP质粒在HEK293T细胞中的表达情况(图3)。实验结果表明NP组在Mr60000附近分别有一条蛋白条带，与SF-NP大小一致，而对照组即空载体(Vec)组并没有相应条带，证明pCAGGS-SF-NP质粒在HEK293T细胞中表达成功。A:小鼠抗NPmAb1A8;B:兔抗FLAGpAb;C:小鼠抗StrepmAb．M:蛋白Mrmarker;NP组:转染pCAGGS-SF-NP;Vec组:转染pCAGGS-SF．图3Westernblot法鉴定pCAGGS-SF-NP转染HEK293T细胞裂解液的结果2．3与NP相互作用蛋白的亲和纯化对HEK293T细胞裂解液进行亲和层析，从而获得了高浓度的目的蛋白。在亲和层析的过程中，留取了每一步的液体，检测其蛋白浓度并进行Westernblot分析(图4)。pCAGGS-SF组和pCAGGS-SF-NP组流洗液中的蛋白浓度随着洗涤次数的增加而降低，最终在第5次洗涤后接近于零，说明与琼脂珠非特异结合的蛋白已基本去除(图4A)。在洗脱过程中，随着脱硫生物素的加入，在图中箭头处，pCAGGS-SF-NP组样本中可以看到一个峰值，说明特异性与琼脂珠结合的融合蛋白SF-NP被竞争脱落，经超滤后获得的样本即仅含SF-NP及其相互作用蛋白。Westernblot结果显示(图4B)，在裂解液和洗脱液的泳道中，均在相对分子质量(Mr)60000左右处出现一条蛋白条带，而流洗液中并未出现，表明洗涤过程充分去除了非特异结合蛋白;同时可以看到，洗脱液泳道中蛋白条带明显粗于裂解液泳道的蛋白条带，表明亲和层析过程富集SF-NP的效果非常明显。收获的样品SDS-PAGE后经
【参考文献】：
期刊论文
[1]连续性肾替代疗法在重症肾综合征出血热患者中的临床治疗效果[J]. 陈天月,张学峰,孟晨鑫. 黑龙江医药. 2018(05)
[2]东南沿海地区1980-2015年汉坦病毒分子特征及流行病学分析[J]. 黄鹏,杨章女,刘源,姚苹苹,胡建利,王笑辰,俞建家,李军,韩亚萍,金柯,杨龙,张云,岳明. 中国媒介生物学及控制杂志. 2017(04)
[3]Hantavirus infection:a global zoonotic challenge[J]. Hong Jiang,Xuyang Zheng,Limei Wang,Hong Du,Pingzhong Wang,Xuefan Bai. Virologica Sinica. 2017(01)
[4]2型登革病毒非结构蛋白NS3的表达及其相互作用蛋白的纯化[J]. 翁代慧,雷迎峰,董阳超,韩佩君,叶传涛,杨敬,王媛,尹文. 细胞与分子免疫学杂志. 2015(12)
博士论文
[1]我国南方地区蝙蝠汉坦病毒的分子流行病学与血清学研究[D]. 徐琳.军事科学院 2018
硕士论文
[1]lncRNA NEAT1调控宿主抗汉滩病毒固有免疫应答分子机制的初步研究[D]. 马宏炜.第四军医大学 2017
本文编号：3603506
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