副溶血弧菌调控蛋白CalR功能的初步研究

发布时间：2017-05-13 04:01

  本文关键词：副溶血弧菌调控蛋白CalR功能的初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一种广泛分布于浅海海水,入海港湾,海洋生物及盐渍加工食品中,能引起人类感染患病的革兰氏阴性嗜盐弧菌。人们若误食了生的或未被彻底煮熟的海产品,可能会被感染。副溶血弧菌主要能够引起三种临床综合症:肠胃炎、伤口感染和败血症。其中最常见是肠胃炎,症状包括腹泻、腹痛、反胃呕吐、头痛和低热。副溶血弧菌分泌多种毒力因子,主要包括耐热直接溶血毒素(Thermostable direct hemolysin,TDH),TDH相关溶血毒素(TDH-related hemolysin,TRH),III型分泌系统(The type III secretion systems,T3SS),VI型分泌系统(The type VI secretion systems,T6SS)及荚膜多糖等。其中TDH可在我妻血琼脂平板上表现为神奈川现象阳性。目前在我国沿海地区,由副溶血弧菌感染引起的食源性疾病占这些地区食源性中毒病例的比例越来越高,所以有必要对其致病机理进行深入探讨。Leu O是Lys R家族的转录调控因子,广泛存在于肠道致病菌中。首先被发现于沙门氏菌(Salmonella)中,且因其能激活亮氨酸合成基因座位leu ABCD的转录而得名。在随后的研究表明,Leu O具有解除静默子H-NS对基因的转录抑制作用,并参与调控多种基因,因此被认为是重要的核心调控子。副溶血弧菌的cal R基因位于菌株基因组I上,该基因长960 bp,G+C含量47.29%,编码分子量为36192.8,由319氨基酸残基组成的蛋白。Cal R是Leu O的同源蛋白,其自身的转录和表达受盐度和Ca2+浓度的双重调节。目前只知它具有抑制T3SS1毒力基因的表达和细菌群集性爬动能力(Swarming),但对其分子机制还一无所知。目的:本文目的在于通过构建副溶血弧菌cal R基因的突变株、回补株和CalR蛋白表达株,进而对Cal R功能进行初步研究。方法:本研究首先利用自杀载体p DS132同源重组的方法构建副溶血弧菌RIMD2210633菌株的cal R无痕突变株(Δcal R),并在突变株的基础上构建了回补株(Δcal R/cal R::p BAD33,简称C-Δcal R)和携带有相关靶基因的Lac Z菌株。通过测定并比较vop N基因(编码T3SS1外膜蛋白)在WT/p BAD33、Δcal R/p BAD33和C-Δcal R中β-半乳糖苷酶活性的差异,来判定Cal R对vop N的调控关系,明确Δcal R是否为非极性突变株;其次,比较WT和cal R突变株在对应激条件下的适应性、菌落透明度、运动能力、生物膜的形成和细胞毒力等一系列的表型实验结果,其中应激环境选择了温度,盐度和酸度三个不同的条件;利用构建好的靶基因Lac Z菌株进行β-半乳糖苷酶活性检测,判断调控因子Cal R与靶基因之间的调控关系;最后用重组克隆方法诱导表达蛋白,镍柱纯化后可得到纯度高的Cal Rhis6蛋白,从而对其DNA活性分析和Cal Rhis6蛋白与靶基因启动子区的结合活性检测奠定基础。结果:Cal R负调控vop N的转录,且回补株的回补效果良好,表明本研究成功构建了副溶血弧菌cal R基因的无痕突变株和回补株。表型实验中:在对温度(4℃)应激条件下的适应性上,一定时间段内(第二天),WT的适应能力明显高于Δcal R;Δcal R生物膜的形成能力高于WT;菌落透明度上,与WT相比,Δcal R更加透明;在运动能力上,Δcal R的爬动能力小于WT,而泳动能力与WT比较无显著性差异;Δcal R的细胞毒力和溶血活性都大于WT;Lac Z报告基因融合实验结果显示:cal R能激活cps A转录活性,对exs A,exs B,vop N,syp G,tdh A的转录具有抑制作用,而对syp A转录无调控作用。Cal Rhis6蛋白成功诱导表达并被纯化。结论:副溶血弧菌中的Cal R对应激环境中细菌的适应性、生物膜的形成、动力,透明度、细胞毒和溶血活性等都有一定的调节作用,具有抑制T3SS1和Vp-PAI的转录活性。
【关键词】：副溶血弧菌 calR 突变株 回补株 表型实验
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.3
【目录】：

• 摘要5-7
• abstract7-12
• 第一章 绪论12-24
• 1.1 副溶血弧菌的生物学特性12
• 1.1.1 形态染色12
• 1.1.2 培养特性12
• 1.1.3 生化反应12
• 1.2 副溶血弧菌毒力研究概述12-17
• 1.2.1 耐热直接溶血素（TDH）和相关溶血素（TRH）13-14
• 1.2.2 III型分泌系统14-15
• 1.2.3 VI型分泌系统15-16
• 1.2.4 多种酶类16
• 1.2.5 粘附因子16-17
• 1.2.6 不耐热的溶血素17
• 1.3 弧菌生物膜形成17-20
• 1.3.1 鞭毛17-19
• 1.3.2 IV型菌毛（type IV pilus）19-20
• 1.3.3 多糖20
• 1.4 细菌密度感应系统（Quorum sensing，QS）20-21
• 1.5 转录调控蛋白Cal R的研究进展21-22
• 1.6 本文研究目的和路线22-24
• 第二章 材料方法24-43
• 2.1 实验材料24-30
• 2.1.1 菌株和质粒24
• 2.1.2 主要试剂24
• 2.1.3 主要溶液24-28
• 2.1.4 主要仪器28-29
• 2.1.5 本文引物汇总29-30
• 2.2 实验方法30-43
• 2.2.1 cal R基因的敲除30-32
• 2.2.2 cal R回补株的构建32-33
• 2.2.3 表型实验33-36
• 2.2.4 Lac Z报告基因融合实验36-39
• 2.2.5 重组蛋白Cal R（Cal Rhis6）的克隆表达39-43
• 第三章 实验结果与讨论43-58
• 3.1 cal R突变株和回补株的构建与验证43-47
• 3.1.1 cal R突变株的构建43-44
• 3.1.2 回补株构建44-46
• 3.1.3 非极性突变株的验证46-47
• 3.2 表型实验和相关基因Lac Z实验47-53
• 3.2.1 菌株对应激条件的适应性47-48
• 3.2.2 菌落透明度48-49
• 3.2.3 菌株动力实验（Swimming和Swarming）49
• 3.2.4 菌株生物膜形成实验49-51
• 3.2.5 Cal R对菌株溶血活性调控51-52
• 3.2.6 Cal R对菌株细胞毒调控52-53
• 3.3 Cal Rhis6蛋白的表达53-55
• 3.3.1 目的基因片段的扩增53
• 3.3.2 Cal Rhis6蛋白表达载体重组克隆的鉴定53-54
• 3.3.3 Cal Rhis6蛋白预表达与纯化54-55
• 3.4 讨论55-58
• 3.4.1 cal R突变株和回补株的构建55-56
• 3.4.2 Cal R对菌株表型的调控56-58
• 第四章 主要结论及展望58-59
• 4.1 主要结论58
• 4.2 下一步的研究方向58-59
• 参考文献59-69
• 致谢69-71
• 攻读硕士学位期间发表的文章71

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