HBc及HBV多表位嵌合基因的构建、表达及在BALB/c小鼠体内诱导的免疫应答研究

发布时间：2022-02-19 23:06

　　慢性乙型病毒性肝炎是严重危害人类健康的传染病，全世界约3亿人感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），占世界人口的5％，年均感染率约为5千万人。我国是HBV感染高发区，HBV携带者达1亿人，约占我国人口10％。HBV感染者中，约5％～10％成人和80％～90％儿童感染者不能清除病毒，发展成为慢性乙肝患者或携带者，其中约5％～20％慢性感染者最后发展为肝硬化或肝细胞癌。对慢性乙型病毒性肝炎的治疗和预防一直是世界性难题，以IFN-α和拉米芙定为主的药物治疗能抑制病毒复制，但有效应答率低、疗程长、费用高，治疗效果并不令人满意，且存在停药后的反跳和长期用药带来的抗药性及病毒变异等问题，一般认为，疫苗接种是预防和治疗慢性乙肝最安全有效而且价廉的措施。 自1997年世界卫生组织（WHO）推荐实施乙肝疫苗计划免疫以来，大范围的疫苗接种有效降低了HBV感染率，为预防慢性乙肝做出了突出贡献，但只含S抗原的基因工程疫苗的不应答或低应答率高达10％～15％，且不能诱导有效的细胞免疫应答，不能诱导慢性HBV感染者或携带者产生保护性应答，因此，其治疗性意义不大。慢性乙肝感染者或携带者... 

【文章来源】：南方医科大学广东省

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

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前言
第一部分 HBc及HBV多表位嵌合基因真核表达质粒的构建与鉴定
    材料与方法
        一、 材料
        二、 实验方法
            (一) 、 HBV多表位基因的设计与合成
            (二) 、 脊区基因缺失的HBc真核表达载体的构建与鉴定
                1 、 PCR扩增HBc1～72aa及HBc93～183aa编码序列
                2 、 脊区基因缺失的HBc基因(HBcdM)的克隆
                3 、 重组克隆的筛选及鉴定
            (三) 、 多表位合成基因(BPT)的克隆及重组子筛选、鉴定
                1 、 PCR扩增多表位基因BPT
                2 、 BPT基因的克隆及重组子筛选、鉴定
    结果
        (一) 基因扩增
        (二) 脊区缺失的HBc真核表达载体构建与鉴定
        (三) 多表位基因(BPT)的克隆及重组子筛选、鉴定
    讨论
    小结
第二部分 HBc及HBV多表位嵌合基因在哺乳动物细胞NS-1内的表达及其稳定表达细胞株的筛选与鉴定
    材料与方法
        一、 材料
        二、 实验方法
            (一) 真核表达载体pHBcMep转染哺乳动物细胞
                1 、 质粒pHBcMep的扩增与纯化
                2 、 基因转染及细胞克隆筛选
            (二) 嵌合基因HBcMep稳定表达细胞株的筛选
            (三) 重组NS/HBcMep细胞表达产物鉴定
                1 、 RT-PCR检测
                2 、 ELISA检测培养上清重组蛋白HBcMep的表达情况
                3 、 间接免疫荧光检测转染细胞的表达情况
                4 、 Western blot检测
            (四) NK细胞活性检测
    结果
        一、 真核表达载体pHBcMep转染哺乳动物细胞
            1 、 质粒的扩增、纯化与鉴定
            2 、 pHBcMep转染细胞的筛选与鉴定
        二、 稳定表达重组NS/HBcMep细胞株的筛选和表达产物的鉴定
            1 、 RT-PCR
            2 、 间接免疫荧光
            3 、 Western-Blot
        三、 BALB/c小鼠脾细胞对重组NS/HBcMep细胞的NK细胞活性
    讨论
    小结
第三部分 HBc及HBV多表位嵌合基因免疫BALB/c小鼠所诱导的免疫应答研究
    材料与方法
        一、 材料
        二、 实验方法
            (一) 质粒制备与纯化
            (二) 动物分组与免疫
            (三) ELISA检测免疫血清抗preS2抗体
            (四) cELISA检测免疫血清抗HBcMep抗体
            (五) 流式细胞术检测免疫小鼠CD_4/CD_8比值
            (六) LDH法检测免疫小鼠的特异性CTL活性
                1 、 刺激细胞的处理
                2 、 脾细胞的收获与预处理
                3 、 LDH法检测CTL活性
            (七) 安全性试验
    结果
        (一) 质粒的扩增、纯化及鉴定
        (二) ELISA检测免疫血清抗preS2抗体
        (三) cELISA检测免疫血清抗HBcMep抗体
        (四) 流式细胞术检测免疫小鼠CD_4/CD_8比值
        (五) LDH法检测免疫小鼠的特异性CTL活性
        (六) 安全性试验
    讨论
    小结
结论
参考文献
综述
致谢
附录: 硕士期间论文发表情况


【参考文献】：
期刊论文
[1]HBV包膜-核心蛋白融合基因DNA疫苗诱导小鼠持久的细胞免疫应答[J]. 赵平,姜春鹏,赵兰娟,温新宇,戚中田.  生物化学与生物物理进展. 2002(04)
[2]乙肝表面抗原核酸疫苗在小鼠体内的阳性表达[J]. 温剑平,杨贵贞.  中国免疫学杂志. 2002(03)
[3]重组治疗性乙型肝炎疫苗（YIC）的实验研究[J]. 闻玉梅,何丽芳,瞿涤,马张妹,姚忻.  中国工程科学. 1999(01)
[4]用细胞酶联免疫吸附法筛选分泌抗人B细胞分化抗原单抗的杂交瘤[J]. 郭彩云,石伟,王汛,朱立平.  基础医学与临床. 1995(02)



本文编号：3633797