筛选和鉴定与东方田鼠抗性基因ILKAP表达蛋白相互结合的日本血吸虫童虫蛋白

发布时间：2023-02-21 18:05

　　目的筛选和鉴定与东方田鼠抗性基因整合素连接激酶相关丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(ILKAP)表达蛋白相互结合的日本血吸虫童虫蛋白。方法提取东方田鼠骨髓细胞蛋白和日本血吸虫童虫蛋白,进行免疫共沉淀,实验组为东方田鼠骨髓蛋白+日本血吸虫童虫蛋白+ILKAP抗体+磁性珠子,阴性对照组以兔IgG抗体代替ILKAP抗体,阳性对照组为东方田鼠骨髓蛋白或日本血吸虫童虫蛋白。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对免疫沉淀复合物进行分离,切取差异性蛋白条带通过基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDITOF-MS)鉴定,获得的混合物肽片段利用Mascot软件进行分析检索。分别以东方田鼠骨髓cDNA和日本血吸虫童虫c DNA为模板, RT-PCR扩增东方田鼠ILKAP (Mf ILKAP)基因和日本血吸虫表膜抗原(Sj TA)基因。将Mf ILKAP和Sj TA基因分别克隆至真核表达载体Flag-pCMV-2b和Myc-pcDNA3.1/(-) b中,构建的重组质粒FlagILKAP-pCMV-2b和Myc-TA-pcDNA3.1/(-) b共转染至HEK293T细胞中作为实验组,设阴性对照组M...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 实验动物来源
    1.2 主要试剂和仪器
    1.3 东方田鼠骨髓细胞的分离
    1.4 日本血吸虫童虫的培养
    1.5 东方田鼠骨髓细胞和日本血吸虫童虫蛋白的提取与测定
    1.6 免疫共沉淀
    1.7 MALDI-TOF-MS分析
    1.8 真核表达载体的构建
    1.9 免疫共沉淀与蛋白质印迹 (Westernblotting) 分析
    1.1 0 伦理批准和患者知情同意
2 结果
    2.1 免疫共沉淀结果
    2.2 Mf ILKAP和Sj TA基因的表达分析
    2.3 Myc-TA-pcDNA3.1/ (-) b和Flag-ILKAP-pCMV-2b重组载体的构建
    2.4 免疫共沉淀与Western blotting分析结果
3 讨论



本文编号：3747751