铜绿假单胞菌与碳青霉烯类耐药相关基因PA0667,PA2734基因功能的研究

发布时间：2017-05-21 14:16

  本文关键词：铜绿假单胞菌与碳青霉烯类耐药相关基因PA0667,PA2734基因功能的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：铜绿假单胞菌是全球主要的引发感染的机会致病菌之一,特别在免疫力低下的病人如烧伤等极易感染。这种致病菌的另一个重要特征就是对目前已知的很多抗生素都有耐药性,因此给临床治疗带来了很大挑战。碳青霉烯类抗生素属于β-内酰胺类抗菌药物的一种,是治疗铜绿假单胞菌感染的重要抗生素之一。然而近年来随着其在临床上的广泛使用,使得铜绿假单胞菌对该类抗生素的耐药性逐年递增,因此给临床治疗带来了极大的难题。因此对该类抗菌药物耐受机理的探索就显得尤为重要。实验室前期通过构建转座突变体库的方法用比亚培南,美罗培南,亚胺培南筛选了与碳青霉烯类抗生素耐药相关的基因。其中PA0667对这三种抗生素敏感性增加,PA2734对三种抗生素敏感性降低。本论文在此基础上对这两个基因进行了敲除突变体的构建并对基因功能进行进一步的研究。在所筛选的突变体中,PA0667对碳青霉烯类抗生素敏感性增加的倍数较为明显。通过研究发现,突变体PAO1(△0667)相比于野生型对比亚培南的敏感性增加了4倍,对美罗和亚胺培南分别增加了2倍和1倍,因此PA0667与碳青霉烯类抗生素的敏感性相关。PAO1(△0667)破坏了外膜的完整性,使小分子物质容易进入。研究发现PAO1(A0667)对于维持稳定性有重要影响,因此导致PAO1(△0667)对抗生素敏感性增加。PA0667为四型基因且功能未知,该基因在大肠杆菌中与蛋白YebA有一定的相似性,该蛋白在大肠杆菌中参与细胞壁的合成。PAO1(A0667)的生长基本与野生型PAO1差别不大。氨苄青霉素的加入使PAO1(A0667)和野生型PAO1的生长与不加该抗生素相比受到抑制。实验表明,突变体PAO1(△0667)对四种青霉素结合蛋白pbpG7,pbp 1 a,pbpB3,pbpA2发光报道子的表达水平与野生型PAO1相比有明显的降低,进一步说明了青霉素结合蛋白在细胞壁肽聚糖的合成过程中发挥着重要影响。PA0667预测是一种与金属内肽酶有关的膜蛋白,有文献表明,金属内肽酶可能是一种潜在的毒性因子。利用中国白菜和果蝇为感染模型,以及运动性实验分别检测了突变体PAO1(△0667)和PAO1的毒性变化,结果显示突变体PAO1(△0667)的毒性与野生型PA01相比明显增加。表明PA0667涉及铜绿假单胞菌的毒性与致病性。为了进一步确证PA0667的功能,对操纵子PA0666-0667敲除突变体的功能进行了初步探索,结果表明PA0666-0667与耐药性和致病性均相关。PA2734在所筛选的基因中对三种碳青霉烯类抗生素抗药性增加较为明显,实验结果显示突变体PAO1(△2734)对比亚培南,美罗培南,亚胺培南的耐药性分别提高了4倍,2倍和4倍。说明PA2734确实与碳青霉烯类抗生素的敏感性相关。PA2734为功能未知的四型基因,预测与限制性内切酶的S亚基有关。研究表明,PA2734的突变会引起运动相关的表达质粒Pi1D,fliC的表达水平降低,并且Swarming, Swimming和Twicthing三种运动的表型与野生型PAO1相比明显降低。突变体粘附性的降低更进一步地反应了PA2734对于细菌定植和扩散的重要性。
【关键词】：铜绿假单胞菌 碳青霉烯类抗生素 耐药性 致病性 PA0667 PA2734
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 缩写对比表12-13
• 第一章 绪论13-23
• 1.1 铜绿假单胞菌和碳青霉烯类抗生素13
• 1.1.1 铜绿假单胞菌13
• 1.1.2 碳青霉烯类抗生素13
• 1.2 铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制13-15
• 1.3 细菌的金属内肽酶15
• 1.4 细菌的细胞壁15-19
• 1.4.1 细菌细胞壁肽聚糖的结构16
• 1.4.2 革兰氏阴性细菌肽聚糖的合成16-17
• 1.4.3 细胞壁外膜的完整性与稳定性17-19
• 1.5 铜绿假单胞菌的致病性19-20
• 1.6 细菌的限制-修饰系统及其分类20-21
• 1.7 研究内容及意义21-23
• 第二章 实验材料和方法23-35
• 2.1 实验材料23-25
• 2.1.1 菌株和质粒23
• 2.1.2 实验仪器23-24
• 2.1.3 实验试剂24
• 2.1.4 培养基的配置24-25
• 2.2 实验方法25-35
• 2.2.1 质粒小剂量提取25-26
• 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备26
• 2.2.3 铜绿假单胞菌感受态细胞的制备26-27
• 2.2.4 电转化27
• 2.2.5 酶切和连接27-28
• 2.2.6 琼脂糖凝胶核酸片段回收纯化28
• 2.2.7 聚合酶链式反应体系28
• 2.2.8 基因敲除实验28-31
• 2.2.9 敲除突变体互补体的构建31
• 2.2.10 铜绿假单胞菌最小抑制浓度(MIC)的测定31
• 2.2.11 抗生素敏感性检测31-32
• 2.2.12 在固体和液体培养基上检测突变体的生长情况32
• 2.2.13 外膜稳定性和外膜完整性32
• 2.2.14 氨节青霉素裂解实验32-33
• 2.2.15 果绳感染实验33
• 2.2.16 白菜实验33
• 2.2.17 运动性实验检测33-34
• 2.2.18 基因报道子发光强度检测34
• 2.2.19 粘附性实验34-35
• 第三章 实验结果35-53
• 3.1 PA0667基因功能的研究35-42
• 3.1.1 PA0667的基本信息35
• 3.1.2 基因PA0667敲除突变体的构建35-36
• 3.1.3 敲除突变体互补体的构建36
• 3.1.4 抗生素敏感性检测36-37
• 3.1.5 PA0667对外膜结构的影响37-38
• 3.1.6 突变体PAO1(A0667)生长情况的检测38-40
• 3.1.7 突变体在几种青霉素结合蛋白中的表达检测40-41
• 3.1.8 氨苄西林(Ampicillin)裂解实验41-42
• 3.2 PA0667对铜绿假单胞菌致病性的影响42-44
• 3.2.1 中国白菜细菌感染实验42-43
• 3.2.2 果蝇感染实验43
• 3.2.3 PA0667对Swarming运动能力的影响43-44
• 3.3 PA0666-PA0667操纵子功能的初步探索44-47
• 3.3.1 PA0666-PA0667敲除突变体的构建44-45
• 3.3.2 PAO1(△0666-0667)抗生素敏感性检测45
• 3.3.3 PA0666-0667外膜稳定性与完整性实验检测45-46
• 3.3.4 PAO1(△0666-0667)白菜实验检测46-47
• 3.4 基因PA2734功能的研究47-53
• 3.4.1 基因PA2734基本信息47
• 3.4.2 PA2734敲除突变体的构建47
• 3.4.3 PA2734敲除突变体的互补体构建47-48
• 3.4.4 PAO1(△2734)抗生素敏感性检测48-49
• 3.4.5 PA2734运动性检测49-50
• 3.4.6 PAO1,PAO1(A2734)中检测发光报道子PilD,fliC的表达50-51
• 3.4.7 粘附性实验51-53
• 第四章 结果与讨论53-56
• 参考文献56-61
• 致谢61

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