HIV-1 Tat与DNA-PKcs相互作用及采用TALEN与CRISPR敲除细胞Tip60的研究

发布时间：2017-05-21 15:05

  本文关键词：HIV-1 Tat与DNA-PKcs相互作用及采用TALEN与CRISPR敲除细胞Tip60的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：HIV-1 Tat蛋白是一个由HIV-1编码的调控蛋白,对于HIV病毒的转录和复制具有至关重要的作用。Tat蛋白可以和宿主细胞内多种蛋白发生相互作用促进HIV病毒转录,并通过诱导淋巴细胞凋亡破坏宿主免疫系统。此外,Tat可以作为一个旁分泌分子由受感染细胞分泌进入未受感染细胞进而增加其感染风险。DNA-PKcs是DNA依赖的蛋白激酶复合物DNA-PK的主要催化亚基,属于磷脂酰肌醇3-激酶超家族(P13K),在DNA损伤后非同源末端修复过程中发挥重要作用。DNA损伤发生后,DNA-PKcs通过Ku蛋白转移到DNA损伤末端,从而被DNA末端激活启动DNA损伤修复反应。不仅如此,DNA-PKcs在V(D)J重组、细胞周期调控、凋亡与自吞噬过程中均发挥重要作用。在此之前我们实验室已经发现Tat能够抑制DNA-PKcs的表达,增强细胞对电离辐射的敏感度,并且能够通过与Plk-1、Cyclin B、Tip60相互作用影响细胞周期变化。此外我们组还证实HIV-1 Tat能够直接结合DNA-PKcs的核心启动子序列参与其表达下调,并首次将DNA-PKcs核心启动子区域由先前报道的-106～-3缩短至-63--1。并发现HIV-1 Tat可以直接激活DNA-PKcs激酶活性,其活性水平与Tat蛋白成剂量依赖关系。在此基础上,我们进行了进一步研究,取得的主要科研进展有：1.通过免疫共沉淀与GST-pull down实验,我们进一步证实了HIV-1 Tat可以直接与DNA-PKcs发生相互作用,同时无论内源还是外源Tat蛋白,都能够明显增强DNA-PKcs的S2056位点磷酸化水平。2.既然DNA-PKcs作为类别转换重组(CSR)的重要组成部分,为探索这一机制我们对Tat蛋白在CSR过程中的作用进行了检测,结果显示低浓度(4μg/ml)的Tat蛋白能够有效抑制类别转换重组的发生,而高浓度(8μg/ml)时则会刺激CSR的发生。3.既然Tat可以与DNA-PKcs相互作用并调控其活性,那么DNA-PKcs是否也可以通过Tat参与调控HIV-1转录水平,结果显示低水平且具有活性的DNA-PKcs对于HIV-1的转录是必不可少的,而DNA-PKcs在高表达水平且激酶活性较低时则能够明显抑制HIV-1的转录。4.免疫共沉淀实验表明DNA-PKcs虽能够与cyclin T1、CDK9、Tat形成一个巨大的复合体,但DNA-PKcs仅仅与CDK9和Tat蛋白直接结合而与cyclin T1并无直接相互作用。我们的研究发现对于未来DNA-PKcs的研究提供了一个新的方向,对Tat蛋白在宿主体液免疫中作用的研究提供了新的思路与理论意义。同时提出了一种的可能性,即是否可以通过对DNA-PKcs的直接抑制和干预抑制艾滋病患者体内HIV-1的转录,这对未来抗HIV治疗及其新药的研制提供了新的策略。Tip60 (Tat interactive protein,60kD)最早是通过酵母双杂交的方法所鉴定出来的可以与HIV 1-tat相互作用的蛋白,由于其分子量为60kd,故被命名为Tip60。Tip60属于MYST乙酰基转移酶家族,主要参与乙酰化组蛋白H2A、H3、H4及多种相关蛋白,调控相关基因转录及下游分子应答。大量文献已经报道Tip60可以作为转录调控因子与核受体及转录因子结合进一步激活或者抑制下游基因的表达,如雄激素受体、AICD/Fe65、NCoR、c-MYC、E2F等,此外Tip60还可以通过乙酰化一系列蛋白调控其活性与稳定性。当DNA双链发生断裂损伤后,Tip60可以通过乙酰化ATM的K3016位点促进ATM发生自磷酸化进而激活下游底物P53、chk2,诱导DNA损伤修复反应。综上所述,我们可以看到Tip60在基因转录、DNA损伤修复、细胞信号转导、细胞周期检查点、凋亡与自吞噬等方面均发挥重要调控作用。此外,Tip60还可以影响肿瘤的发生与发展,它的失活将会导致DNA损伤修复缺陷及癌症风险的增加。由于Tip60基因双位点敲除小鼠会导致胚胎致死,我们分别采用了当前最先进的TALEN与CRISPR两种基因敲除技术在细胞水平稳定敲除内源性Tip60基因,建立能够稳定敲除Tip60基因的细胞系,为后续研究Tip60在DNA损伤修复、细胞周期调控、自吞噬调控中的作用打下基础。TALEN技术实验流程：首先根据Tip60基因序列并结合生物信息学设计多个靶位点识别序列；分别根据识别序列进行TALEN质粒对的构建工作；成功构建并测序验证后提取质粒；直接采用提取的TALEN质粒对转染HEK293细胞,并于转染48h后提取多克隆细胞基因组；采用对应引物PCR扩增含有切割位点的基因序列,并于回收后进行退火处理,最后采用T7核酸内切酶酶切检测靶位点是否发生变化进而对TALEN切割效率进行检测。接下来选择具有较高切割效率的TALEN质粒对转染细胞；并于48h后将细胞稀释至96孔板培养,使每孔理论上只有一个细胞；当培养约4-5周左右待细胞长满后传至12孔板继续扩增培养；待其再次长满后取部分细胞提取单克隆细胞基因组；采用PCR技术扩增靶片段,并将单克隆细胞基因组PCR回收产物与野生型细胞基因组PCR回收产物混合后退火处理；采用T7内切酶酶切鉴定筛选阳性单克隆；选择阳性片段克隆到T载体,测序筛选移码突变细胞系,筛选Tip60基因稳定敲除的细胞系。CRISPR技术实验流程：CRISPR技术同样根据Tip60基因序列并结合生物信息学设计多个靶位点识别序列并根据设计的靶位点进行CRISPR识别序列的构建；待识别序列构建好并测序验证成功后通过慢病毒包装系统包装为慢病毒；将包装好的CRISPR慢病毒感染U20S细胞,感染48h后使用嘌呤霉素对细胞进行处理,将筛选过的细胞再次感染Cas9腺病毒后提取细胞基因组；采用对应引物PCR扩增含有切割位点的基因序列并退火处理,最后采用T7核酸内切酶酶切检测CRISPR切割效率与活性。选择具有较高切割效率的CRISPR慢病毒感染细胞48小时并用puro处理一周后感染腺病毒；将存活细胞稀释至96孔板中进行培养,使每孔理论上只有一个细胞；之后筛选工作与TALEN技术相同,采用T7内切酶酶切鉴定筛选出稳定敲除Tip60基因的细胞系。我们采用以上两种技术筛选出可以对靶位点进行高效切割的TALEN质粒对与CRISPR慢病毒进行细胞转染,最终通过T7内切酶酶切检测成功筛选出Tip60基因单位点稳定敲除的细胞系。为后续我们研究Tip60在DNA损伤修复、细胞周期调控、自吞噬中的作用及其详细分子机制打下了很好的基础。
【关键词】：HIV-1 Tat DNA-PKcs Tip60 TALEN CRISPR 基因敲除
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373
【目录】：

• 英文缩略词表4-6
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-17
• 材料与方法17-34
• 结果34-47
• 讨论47-51
• 结论51-52
• 参考文献52-55
• 综述55-62
• 代表性论著62-74
• 个人简历74-75
• 在学期间的研究成果目录75-76
• 致谢76

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 谢明;;转基因技术可使人类更聪明[J];技术与市场;2010年06期

2 Ferdinand FI ,刘伟;HIV疫苗发展的前景[J];微生物学免疫学译刊;1988年01期

3 ;单卵子高精度全基因组测序首度完成——或对人类生殖史产生里程碑式影响[J];生物学通报;2014年01期

4 徐永华;;动物细胞基因组的DNA顺序结构和表达[J];细胞生物学杂志;1981年01期

5 彭宪生,赵建升,王平;人精细胞基因组DNA的分离提纯方法及其含量测定[J];遗传;1992年05期

6 ;中国细胞生物学学会第六届学术大会第一轮通知[J];细胞生物学杂志;1994年03期

7 陆佳韵,王秀琴,吴e，

本文编号：383986