体细胞与早期胚相互作用的初步探讨

发布时间：2017-05-21 17:16

  本文关键词：体细胞与早期胚相互作用的初步探讨，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的探索体细胞BMMSCs/HSC/MEF能否在早期胚的环境影响下去分化为类似胚胎干细胞的多能干细胞,为诱导体细胞为多能干细胞提供实验基础和新思路。方法1.原代分离和培养携带报告基因EGFP的SCE小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast,MEF)、骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell,BMMSCs)、造血干细胞(Hematopoietic Stem Cell,HSC)并鉴定获得稳定传代的细胞系;2.MEF、BMMSCs经5-氮杂胞苷去甲基化后按ESC培养方案培养,备用;3.通过显微注射将携带报告基因EGFP的MEF、BMMSCs、HSCs直接注射或者去甲基化24h后的MEF和BMMSCs注入到野生型ICR小鼠的8-cell(8~10个)、囊胚(10~15个),转至KSOM培养液滴中体外培养48h后置荧光显微镜下观察,计数囊胚率、MEF/BMMSCs/HSC嵌合体囊胚率和MEF/BMMSCs/HSC纯合子囊胚率;4.部分显微注射后的8-细胞胚在KSOM液滴中体外培养24h,囊胚培养2h后移植至假孕2.5d的野生型ICR雌鼠的子宫内。结果1.获得了SCE-MEF细胞系,去甲基化处理后的SCE MEF分化细胞系;2.获得了SCE-BMMSCs细胞系,体外定向成骨和成脂诱导分别进行vonkossa和油红O染色鉴定,分子标志物分析CD34阴性、OCT4和NANOG阳性;3.利用Mebiol Gel 3D培养法分离获得SCE-HSC细胞系,分子标志物CD34、ABCG2、CD133均表达阳性,体外可诱导为粒系和红系的分化细胞;4.分别将SCE MEF/BMMSCs/HSC直接注射或者去甲基化后注射到8-cell胚和囊胚中,均可存活,但未见到增殖和对胚的嵌合,移植小鼠未嵌合。结论1.小鼠骨髓间充质干细胞、造血干细胞、成纤维细胞、去甲基化处理的骨髓间充质干细胞和成纤维细胞,分别注射到小鼠8-cell胚和囊胚中均可存活,但未见到增殖和对胚的嵌合,初步表明这些细胞难于受到早期胚的影响发生分化状态的变化。2.首次发现,去甲基化后的小鼠成纤维细胞,在胚胎干细胞培养条件下可以原代转分化为粘附紧密的上皮样细胞克隆,且可传代。克隆表达多种胚胎干细胞的特征分子标记(OCT4、NANOG、SSEA-1)。表明去甲基化处理联合胚胎干细胞化培养,可促使小鼠成纤维细胞向胚胎干细胞方向转化。这为改良i PSC技术,建立非基因转染方法制备i PSC提供了有益的新思路。3.首次成功建立了一种基于温敏式水凝胶3D培养分离小鼠造血干细胞的新技术,可以简便、快速、高效地分离造血干细胞。为小鼠造血干细胞研究和进一步研发用于血液病再生医学的人类造血干细胞分离技术奠定了重要基础。
【关键词】：早期胚 成体干细胞 成纤维细胞 3D培养 DNA去甲基化
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R321
【目录】：

• 中英文缩略词表5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-15
• 材料和方法15-50
• 1. 材料15-25
• 1.1 实验动物15
• 1.2 实验设备15-16
• 1.3 实验试剂16-17
• 1.4 主要试剂的配制17-25
• 2. 实验方法25-50
• 2.1 小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse Embryonic Fibroblast，MEF）的制备25-32
• 2.2 骨髓间充质干细胞的制备32-40
• 2.3 造血干细胞的制备40-44
• 2.4 不育雄鼠的制备44
• 2.5 胚胎供体鼠准备44
• 2.6 代孕母鼠准备44-45
• 2.7 供体 8-细胞胚胎/囊胚的获得45
• 2.8 注射针及持卵针的制备45-46
• 2.9 显微注射46-48
• 2.10胚胎体外培养48
• 2.11子宫移植48-49
• 2.12 MEF/BMMSCs源小鼠的筛选49-50
• 结果50-61
• 1. SCE MEF去甲基化后类ESC培养观察50-51
• 2. SCE MEF去甲基化后类ESC培养分子标志物分析51
• 3. SCE BMMSCs的原代培养观察51-52
• 4. SCE BMMSCs的成脂、成骨诱导分化结果观察52-53
• 5. SCE BMMSCs分子标志物分析53-54
• 6 SCE BMMSCs去甲基化后类ESC培养观察54
• 7. SCE HSCs原代培养观察54-55
• 8. SCE HSCs表面标志物分析55
• 9. SCE HSCs体外诱导细胞形态学和表面标志物分析55-56
• 10. SCE MEF/BMMSCs/HSC显微注射后发育观察56-59
• 11. 胚胎发育情况59
• 12. 胚胎移植及MEF/BMMSCs/HSC源小鼠的筛选59-61
• 讨论61-65
• 结论65-66
• 参考文献66-70
• 综述70-77
• 参考文献74-77
• 致谢77-78

【共引文献】

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本文编号：384299