表达HIV-Ⅰ多价野生基因和合成基因重组痘苗病毒疫苗株的构建及与DNA疫苗联合免疫效果的研究

发布时间：2023-08-06 20:10

　　人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)是引起艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrom, AIDS)的病原。目前，艾滋病的流行已经严重威胁到人类的健康和发展，从历史经验和长远考虑，发展安全、有效的疫苗是预防和控制艾滋病的根本途径和有效措施之一。 考虑到安全性，用于临床试验的疫苗株都要求不带筛选标记。活载体疫苗能够以天然的方式加工和合成抗原并呈递给免疫系统，从而诱导较强的细胞免疫和体液免疫应答。密码子优化可以明显提高抗原的表达量及DNA疫苗免疫反应的强度。以痘苗病毒为载体的活载体疫苗已经进入临床试验并取得一定效果。本研究的目的是基于我国HIV-1主要流行株B’／C重组株CN54，构建两株不带筛选标记的多价重组痘苗病毒疫苗株，并与相应的DNA疫苗联合免疫BALB／c小鼠，从而探讨其诱发的HIV特异性免疫应答。同时设立平行实验组，比较HIV密码子优化的合成基因野生型基因诱导的细胞免疫和体液免疫应答之间是否存在差异，为我国艾滋病疫苗的临床试验提供参考。 本实验首先构建了含有neo基因和lacZ基因双重...

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摘要
Abstract
缩略语表
前言
    1. HIV简介
        1.1 HIV的发现及分类学地位
        1.2 HIV的基因组结构
        1.3 HIV的生物学特征
    2. HIV疫苗研究中的动物模型
    3. HIV感染的细胞免疫应答
    4. HIV感染的体液免疫应答
    5. 艾滋病疫苗的研究策略
        5.1 传统的艾滋病疫苗研究策略
        5.2 新型艾滋病疫苗研究策略
            5.2.1 DNA疫苗的研究进展
            5.2.2 活载体疫苗的研究进展
    6. 免疫治疗
    7. 临床试验
    8. 实验目的
材料和方法
    1. 材料
        1.1 工具酶
        1.2 试剂盒
        1.3 质粒和菌株
        1.4 细胞和毒株
        1.5 抗体和多肽
        1.6 主要生化试剂
        1.7 实验动物
        1.8 主要仪器
        1.9 常用溶液配方
    2. 实验方法
        2.1 转移质粒载体pVI75的构建
            2.1.1 重组质粒pJSD-neo的构建
            2.1.2 lacZ'-PH6-neo-polyA片段的获得
            2.1.3 大片段lacZ'-PH6-neo-polyA克隆及测序
            2.1.4 转移质粒载体pVI75的构建
        2.2 重组转移质粒载体pVI75-gagpol的构建
        2.3 重组转移质粒载体pVI75-syngpnef-syngp120的构建
            2.3.1 重组质粒pVI75-syngp120的构建
            2.3.2 PCR扩增含有启动子pE／L的目的片段pE／L-syngp120
            2.3.3 片段pE／L-gp120克隆及测序
            2.3.4 重组质粒pVI75-syngpnef-syngp120的构建
        2.4 重组痘苗病毒疫苗株rVV-gagpol的构建、筛选及纯化
            2.4.1 重组质粒pVI75-gagpol与痘苗病毒天坛株共转染鸡胚细胞
            2.4.2 重组痘苗病毒的筛选
            2.4.3 重组痘苗病毒rVV-gagpol的鉴定
        2.5 重组痘苗病毒疫苗株rVV-syngpnef-syngp120的构建、筛选及纯化
            2.5.1 重组质粒pVI75-syngpnef-syngp120与痘苗病毒天坛株共转染鸡胚细胞
            2.5.2 重组痘苗病毒的筛选
            2.5.3 重组痘苗病毒rVV-syngpnef-syngp120的鉴定
        2.6 动物实验
            2.6.1 免疫原的制备
            2.6.2 免疫剂量和途径
            2.6.3 免疫方案及程序
            2.6.4 结合抗体的检测
            2.6.5 小鼠血清中Gag特异性IgG亚类抗体IgG2a和IgG1的检测
            2.6.6 流式细胞仪检测细胞免疫反应水平
结果与分析
    1. 转移质粒载体pVI75的构建
        1.1 质粒pJSD-neo的酶切分析
        1.2 片段lacZ'-PH6-neo-polyA的获得
            1.2.1 PCR扩增片段PH6-neo-polyA
            1.2.2 PCR扩增lacZ'
            1.2.3 PCR扩增片段lacZ'-PH6-neo-polyA
        1.3 将片段lacZ'-PH6-neo-polyA连接到T载体并进行测序分析
        1.4 转移质粒载体pVI75的酶切鉴定
    2. 重组质粒pVI75-gagpol的鉴定
    3. 重组转移质粒载体pVI75-syngpnef-syngp120的构建
        3.1 重组质粒pVI75-syngp120的构建
        3.2 PCR扩增含有启动子pE／L的目的片段pE／L-syngp120
        3.3 质粒pT-pE／L-syngp120的鉴定及测序分析
        3.4 重组质粒pVI75-syngpnef-syngp120的酶切鉴定
    4. 重组痘苗病毒rVV-gagpol的构建
        4.1 重组痘苗病毒目的基因gagpol的PCR鉴定
        4.2 抗体染色法筛选重组痘苗病毒
        4.3 Western blot检测重组痘苗病毒rVV-gagpol中目的基因的表达
        4.4 痘苗病毒rVV-gagpol的Dot blot鉴定
    5. 重组痘苗病毒rVV-syngpnef-syngp120的构建
        5.1 重组痘苗病毒rVV-syngpnef-syngp120目的基因的PCR鉴定
        5.2 Western blot检测重组痘苗病毒表达的Syngpnef和Syngp120蛋白
        5.3 重组痘苗病毒rVV-syngpnef-syngp120的Dot blot鉴定
        5.4 重组痘苗病毒的纯化鉴定
    6. 动物免疫实验结果
        6.1 血清Gag特异性结合抗体IgG水平的检测
        6.2 血清Gag特异性IgG2a、IgG1亚类抗体水平的检测
        6.3 血清Env特异性结合抗体IgG水平的检测
        6.4 流式细胞仪检测细胞免疫反应水平
讨论
    1. 重组痘苗病毒疫苗株筛选平台的建立
    2. 抗原的选择
    3. 表达HIV多价重组痘苗病毒疫苗株的筛选和鉴定
    4. 免疫效果的研究
        4.1 gagpol组和syngpnef组小鼠体内诱发的免疫应答
        4.2 syngpnef+syngp120组和syngpnef-syngp120组小鼠体内诱发的免疫应答
小结
参考文献
致谢
附录



本文编号：3839975