人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的构建及验证

发布时间：2024-02-19 18:26

　　目的利用人源抗狂犬病病毒ScFv噬菌体抗体库,构建单克隆抗体(单抗)轻、重链质粒,瞬时表达,纯化后验证具有高中和活性的单抗。方法以从ScFv噬菌体抗体库中筛选获得特异性抗体为模板,PCR扩增抗体轻、重链可变区序列,构建人源全分子抗体瞬时转染质粒;轻、重链质粒混合后转染HEK293 EBNA1细胞,瞬时表达全分子抗体。采用Mabselect SuRe介质手动亲和纯化抗体,Nano Vue超微量分光光度计测定蛋白质的质量浓度,快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT)进行体外中和效价验证。结果成功构建22个轻链质粒,15个重链质粒。通过真核细胞瞬时表达后,经手动亲和纯化后,获得22株单抗。除1株抗体外,其余21株抗体的蛋白质量浓度均>300μg/mL;部分抗体纯度均在90%以上。中和活性结果显示,5株在1 500～1 800 IU/mg之间;8株在800～1 500 IU/mg之间;7株在500～800 IU/mg之间;其余2株在500 IU/mg以下。结论成功构建并验证获得20株中和活性>500 IU/m...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 毒种、细胞
    1.2 抗RV噬菌体抗体库
    1.3 主要试剂及仪器
    1.4 目的基因的扩增及产物的鉴定
    1.5 单抗轻、重链质粒的构建
        1.5.1 质粒的构建
        1.5.2 质粒的验证
    1.6 单抗轻、重链质粒序列分析
    1.7 HEK293-EBNA1细胞瞬时转染
    1.8 单抗的亲和纯化
    1.9 抗RV单抗效价检测
    1.10 统计学分析
2 结 果
    2.1 目的基因的扩增及产物的鉴定
    2.2 单抗轻、重链质粒的构建
        2.2.1 抗RV单抗轻、重链序列及载体的酶切
        2.2.2 抗RV单抗轻、重链质粒序列验证
    2.3 抗RV单抗轻、重链质粒序列分析
    2.4 轻、重链质粒的质量浓度
    2.5 抗RV单抗的蛋白质量浓度
    2.6 抗RV单抗纯度测定
    2.7 抗RV单抗的体外中和效价
        2.7.1 病毒株80%感染量测定
        2.7.2 抗体中和活性
3 讨 论



本文编号：3903132