结核分枝杆菌特异性蛋白的原核表达、纯化及免疫原性分析

发布时间：2017-05-24 09:10

  本文关键词：结核分枝杆菌特异性蛋白的原核表达、纯化及免疫原性分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)俗称结核杆菌,是引起结核病的致病菌,目前仍然是一种高死亡率的慢性传染性疾病。1998年结核分枝杆菌全基因组测序工作完成,发现PE和PPE两大核心蛋白家族,整个基因组中约有10%的开放读框编码这两大家族。由于其N端具有保守的Pro-Glu,PE和Pro-Pro-G lu,PPE基序,因此被命名为PE/PPE蛋白家族。PE家族共有99个成员,每个成员的N端均具有由110个氨基酸残基组成的保守序列。通过生物信息学分析PE蛋白家族的特点,发现其蛋白家族中主要富含以GGXGG的基序,因此我们推测GGXGG为主要抗原表位。PPE家族共有69个成员,每个成员N端均具有由180个氨基酸残基组成的保守序列。目前这两大家族的结构和功能尚不明确,但推测与细菌毒力有关,在抗原变异及免疫逃逸过程中起重要作用。目前,各种MTB特异性抗原不断被研究发现,为结核抗体的检测奠定了良好的基础。本研究通过原核表达多种MTB特异性抗原,分析比较其特异性及敏感性,探讨不同抗原的反应模式。本研究分为以下两个部分:第一部分:结核分枝杆菌PE及PPE家族相关基因的体外合成,原核表达及免疫原性分析通过GenBank数据库查询,分别从结核分枝杆菌PE及PPE蛋白家族中各选择一段高度保守序列,翻译成经大肠杆菌密码子优化的三段序列PE-PGRS33(110aa)、PPE38(180aa),PE-PGRS52(637-731aa),构建并原核表达这三段序列。具体方法如下:分别获得PE-PGRS33(110aa)、PPE38(180aa),PE-PGRS52(637-731aa)基因片段,利用OE-PCR原理设计特异性引物进行体外基因合成PE-PGRS33(110aa)、ppe38(180aa),pe-pgrs52(637-731aa)三个片段。将合成后的三个片段利用t/a克隆法克隆至pmd18-t载体鉴定测序。将测序正确的序列与原核表达载体pet32a连接,构建其原核表达质粒:pet32a/pe-pgrs33(110aa)、pet32a/ppe38(180aa),pet32a/pe-pgrs52(637-731aa),将上述3种原核表达质粒分别转入e.colibl21(de3)中,经iptg诱导表达,其中,pet32a/pe-pgrs33(110aa)、pet32a/ppe38(180aa)未表达成功,pet32a/pe-pgrs52(637-731aa)小量诱导可见明显表达条带,其相对分子量约为28kd,用ni-nta亲和层析法纯化目的融合蛋白。通过12%sds-page电泳分析,可见分子量约为28kd左右的特异条带,大小与理论值相符。表明本研究成功构建并表达出pet32a/pe-pgrs52(637-731aa)融合蛋白。将纯化的目的蛋白免疫balb/c小鼠,制备抗血清,elisa检测结果显示pet32a/pe-pgrs52(637-731aa)和peptide/pe-pgrs52(637-731aa)与免疫兔血清呈特异性反应,其igg抗体滴度分别为1:32000和1:16000,与pet32a蛋白仅有较弱的结合反应。说明我们设计的这一段以ggngg为抗原表位的序列在体外基因合成表达表达,纯化的蛋白具有很好的免疫原性,同时也反映了ggngg是抗原决定中心,为今后结核病初期诊断试剂盒和疫苗的研究提供参考。第二部分结核分枝杆菌特异性蛋白的基因克隆、原核表达及免疫原性初步分析通过genbank数据库查询6种结核分枝杆菌核苷酸序列,根据查询的核苷酸序列设计扩增引物,在上下游引物中分别加入合适的酶切位点及酶切位点保护碱基,以h37rv基因组为模板分别扩增上述6种基因。将扩增产物回收纯化,然后与pmd-18t载体连接,pcr鉴定并测序,将测序正确的质粒与原核表达载体pet32a连接,构建原核表达质粒,将这6种质粒转化至e.colibl21(de3)中,经iptg诱导表达,用合适的方法纯化这6种蛋白。elisa检测结果显示,以80份结核患者血清以及96份正常成年人血清为样本,通过间接elisa方法检测各个蛋白的抗原性,结果显示pet32a/pe-pgrs52(637-731aa)的特异性为97.9%,敏感性为37.5%;与rv0934,rv0831c联合检测后,敏感性明显提高;这表明pet32a/pe-pgrs52(637-731aa)作为单一抗原用于血清学检测意义不大,但可以作为结核联合诊断的备选抗原。总结:1.本研究成功构建3种结核分枝杆菌特异性原核表达质粒,经E.coli诱导表达,获得了1种结核分枝杆菌PE家族的一段截短蛋白。2.所构建的PE-PGRS52蛋白较好的保留了免疫原性。3.本研究成功构建并表达了6种结核分枝杆菌特异性蛋白,重组的6种蛋白利用间接ELISA法进行了免疫原性分析,初步的研究结果为进一步的分析和筛选临床用于检测结核病提供了一定的实验依据。
【关键词】：结核分枝杆菌 PE PPE 特异性 敏感性
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-15
• 第一部分:结核分枝杆菌PE及PPE家族相关基因的体外合成,原核表达及免疫原性分析15-37
• 引言15-17
• 材料与方法17-29
• 实验结果29-35
• 讨论35-37
• 第二部分 结核分枝杆菌特异性蛋白的基因克隆、原核表达及免疫原性初步分析37-45
• 材料与方法37-38
• 实验方法38-40
• 实验结果40-43
• 讨论43-45
• 结论45-46
• 参考文献46-49
• 附录49-50
• 致谢50-51
• 综述51-58
• 参考文献56-58

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本文编号：390337