心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备及应用

发布时间：2017-05-24 11:08

  本文关键词：心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备及应用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：心型脂肪酸结合蛋白(Heart Fatty Acid-binding Protein, H-FABP)是一种在心肌细胞中含量丰富的小分子量心肌可溶性蛋白,由于其分子量小的特点,在心肌受损后,2-3小时血清浓度即开始上升。检测病人血清中的H-FABP含量从而能确定心梗的发生。每年全球因心血管疾病死亡的人数占全球死亡人数的1/3。而在心梗发生6小时内实施再灌注治疗,则死亡率降低到1%之内,为此早期诊断AMI有着十分重要的意义。而H-FABP作为一种早期的AMI心肌标志物就同样具有着重要的研究意义。本文通过重组H-FABP蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾脏的B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。经过亚克隆筛选出3株高效价的细胞株,分别命名为2C06、2F08、6G03。将三株杂交瘤细胞接种于BALB/c小鼠内大规模制备单克隆抗体。采用Protein G亲和柱纯化抗体后,经鉴定3株单克隆抗体均为IgG类,效价均达到1：106以上,亲和力达到108以上。同时特异性检测和Western blot均表明3株抗体有较好的特异性。采用双抗体夹心ELISA配对抗体,筛选出以61G03为包被抗体与2F08为标记抗体配对能检测出H-FABP抗原,用这对抗体建立了酶联免疫分析方法和胶体金免疫层析法。通过优化条件,建立的酶联免疫分析方法的检测范围为0ng·mL-1～200 ng·mL-1,标准曲线的R2为0.9935,有较好的线性相关性。通过检测临床样本测定出正常人群血清中的H-FABP平均含量为2.6621±0.1321 ng·mL-1、AMI患者H-FABP平均含量为22.4897±1.8217 ng·mL-1, P0.05,表明正常人血清中H-FABP含量与AMI患者血清中H-FABP含量有着显著性差异。建立的胶体金免疫层析法的最低检出浓度为10 ng·mL-1,通过检测131例临床样本,与临床结果对照,敏感度为86.96%,特异度为97.65%,Kappa值为0.8633,一致性检测表明胶体金试纸条检测结果与临床确诊结果无显著性差异。所以建立的酶联免疫分析法和胶体金免疫层析法都适合H-FABP的检测。H-FABP单克隆抗体的制备以及免疫分析方法的建立为国内AMI早期诊断试剂盒的研发奠定了良好的基础。进一步研发更优秀的免疫分析方法检测H-FABP试剂盒,将会明显的改善我国检测H-FABP依赖进口的现状,明显降低医疗成本。
【关键词】：心型脂肪酸结合蛋白 单克隆抗体 酶联免疫分析 胶体金
【学位授予单位】：广东工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392-33
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-7
• 目录7-10
• CONTENTS10-13
• 第一章 绪论13-25
• 1.1 FABP概述14-15
• 1.1.1 FABP的特性14
• 1.1.2 FABP的结构特点14
• 1.1.3 FABP的生物学功能14-15
• 1.2 FABP的临床应用15-16
• 1.2.1 用于AMI的早期特异性诊断15
• 1.2.2 用于梗塞面积的早期估计15
• 1.2.3 用于监测AMI的复发15-16
• 1.3 H-FABP分析检测方法研究进展16-17
• 1.3.1 放射免疫法16
• 1.3.2 酶联免疫吸附法16
• 1.3.3 免疫比浊法16-17
• 1.3.4 胶体金层析法17
• 1.4 免疫分析测试技术介绍17-23
• 1.4.1 基本定义18-19
• 1.4.2 免疫分析方法研究进展19-23
• 1.5 课题研究的目的及其意义23-24
• 1.6 本课题的研究思路及内容24
• 1.7 课题来源24-25
• 第二章 H-FABP单克隆抗体的制备25-48
• 2.1 前言25
• 2.2 材料与试剂25-28
• 2.2.1 动物与细胞25
• 2.2.2 主要试剂和材料25-26
• 2.2.3 实验仪器26-27
• 2.2.4 溶液配制27-28
• 2.3 实验方法28-40
• 2.3.1 动物免疫28
• 2.3.2 免疫血清效价测定28-29
• 2.3.3 制备杂交瘤细胞29-31
• 2.3.4 杂交瘤的筛选及亚克隆31-33
• 2.3.5 单克隆抗体的大规模制备33
• 2.3.6 单克隆抗体的纯化33-35
• 2.3.7 H-FABP单克隆抗体的性质鉴定35-40
• 2.4 实验结果40-47
• 2.4.1 免疫血清效价测定40-41
• 2.4.2 杂交瘤细胞的观察和筛选41
• 2.4.3 腹水纯化后抗体的含量41-42
• 2.4.4 SDS-PAGE电泳测定抗体纯度42
• 2.4.5 腹水纯化后效价测定42-43
• 2.4.6 抗体亚型的测定43
• 2.4.7 抗体亲和力常数的测定43-45
• 2.4.8 抗体的特异性结果45-47
• 2.4.9 WESTERN BLOT测定抗体结果47
• 2.5 本章小结47-48
• 第三章 H-FABP单克隆抗体的免疫分析方法的建立48-62
• 3.1 前言48
• 3.2 仪器与试剂48-49
• 3.2.1 试剂与材料48
• 3.2.2 仪器与设备48-49
• 3.3 实验方法49-55
• 3.3.1 酶联免疫分析法的建立49-51
• 3.3.2 胶体金免疫层析法的建立51-55
• 3.4 结果与分析55-61
• 3.4.1 酶联免疫分析法测定H-FABP55-56
• 3.4.2 胶体金免疫层析法测定H-FABP56-61
• 3.5 本章小结61-62
• 第四章 H-FABP单克隆抗体免疫分析方法的应用62-66
• 4.1 前言62
• 4.2 实验材料62
• 4.3 实验方法62-65
• 4.3.1 样本血清的收集62
• 4.3.2 H-FABP抗体的制备、纯化以及鉴定62-63
• 4.3.3 H-FABP的检测63
• 4.3.4 实验结果63-65
• 4.4 本章小结65-66
• 结论与展望66-67
• 参考文献67-74
• 攻读硕士期间发表的论文74-76
• 致谢76

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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3 魏光伟;余永鹏;魏文康;罗胜军;;化学发光免疫分析技术及其应用研究进展[J];动物医学进展;2010年03期

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本文编号：390581