小鼠Fcα/μR组织学定位初步研究

发布时间：2024-11-19 07:59

　　Fcα/μR是一种近年发现的能够与IgA、IgM结合的Fc受体,基因表达谱广泛,在小鼠多种脏器组织中均检测到其mRNA的表达。小鼠Fcα/μR(mFcα/μR)可以介导B细胞对免疫复合物的内吞,但是有关Fcα/μR生物学功能的更多研究尚在进行中。pIgR也是一种IgA、IgM受体,担负着将pIgA转运至粘膜细胞表面的重要使命,是机体粘膜免疫的重要分子。由于Fcα/μR与pIgR在染色体的基因定位相邻,且二者序列蛋白序列同源性较高,加之在与IgA、IgM结合功能方面具有相似性,因此,本论文将mFcα/μR与mpIgR进行了对比分析,以期为mFcα/μR的功能研究提供更有力的证据。 首先,本论文的研究从抗体的制备着手。通过原核表达的方法得到了mFcα/μR及mpIgR重要结构域蛋白,并以纯化过的表达蛋白为抗原免疫大鼠,制备了大鼠抗mFcα/μR及mpIgR单克隆、多克隆抗体。经过ELISA、Western blot、FACS及细胞免疫化学等方法的多次鉴定,挑选出了可以特异识别mFcα/μR及mpIgR的单克隆抗体,确定了多克隆抗体的抗原识别特异性。 为了探讨mFcα/μR的组...

【文章页数】：120 页

【学位级别】：博士

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目录
摘要
Abstract
英文缩略语对照表
第一章 前言
第二章 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 工具酶、限制性内切酶、分子量标准及试剂盒
        2.1.2 菌株与细胞株
        2.1.3 PCR扩增用引物
        2.1.4 主要试剂及抗体
        2.1.5 cDNA及质粒载体
        2.1.6 实验动物
        2.1.7 主要仪器设备
        2.1.8 常用分析软件
    2.2 实验方法
        2.2.1 目的蛋白的原核表达
            2.2.1.1 组织或细胞总RNA的提取
            2.2.1.2 反转录反应
            2.2.1.3 PCR反应
            2.2.1.4 琼脂糖凝胶电泳
            2.2.1.5 琼脂糖凝胶分离DNA片段的回收
            2.2.1.6 E.coli感受态细胞的制备
            2.2.1.7 质粒的小量提取
            2.2.1.8 DNA分子的酶切与连接
            2.2.1.9 DNA转化感受态细胞
            2.2.1.10 PCR鉴定重组菌落——菌落PCR(Colony PCR)
            2.2.1.11 菌种的保藏
            2.2.1.12 目的蛋白的小量诱导表达
            2.2.1.13 目的蛋白的大量诱导表达
            2.2.1.14 包涵体的纯化
            2.2.1.15 His-tag蛋白的镍柱纯化
            2.2.1.16 蛋白质浓度测定
            2.2.1.17 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
            2.2.1.18 Semi-dry Western blot(蛋白印迹)
            2.2.1.19 目的蛋白与Sepharose 4B的交联
        2.2.2 单克隆抗体的制备及应用
            2.2.2.1 动物的免疫
            2.2.2.2 骨髓瘤细胞的培养
            2.2.2.3 收集脾细胞
            2.2.2.4 饲养细胞的制备
            2.2.2.5 细胞融合
            2.2.2.6 挑克隆
            2.2.2.7 阳性克隆的筛选
            2.2.2.8 阳性细胞亚克隆及鉴定
            2.2.2.9 阳性细胞的大量培养及冻存
            2.2.2.10 单克隆抗体获得及纯化
            2.2.2.11 FITC标记蛋白质
            2.2.2.12 FACS法检测抗体与细胞膜表面受体的结合情况
            2.2.2.13 免疫共沉淀法检测抗体与细胞中未知蛋白的结合情况
        2.2.3 免疫组织(细胞)化学
            2.2.3.1 石蜡切片的免疫组织化学
            2.2.3.2 冰冻切片的免疫组织化学
        2.2.4 免疫细胞化学
            2.2.4.1 盖玻片的处理:
            2.2.4.2 细胞在盖玻片上的生长:
            2.2.4.3 细胞染色前洗涤及固定
            2.2.4.4 细胞免疫化学染色步骤
        2.2.5 真核细胞转染
第三章 实验结果
    3.1 小鼠Fcα/μR的组织及细胞学定位
        3.1.1 大鼠抗小鼠Fcα/μR单克隆及多克隆抗体的制备及鉴定
            3.1.1.1 小鼠Fcα/μR(mFcα/μR)的原核表达
            3.1.1.2 大鼠抗mFcα/μR单克隆抗体的制备及鉴定
            3.1.1.3 大鼠抗mFcα/μR多克隆抗体的鉴定
        3.1.2 大鼠抗小鼠pIgR单克隆抗体的制备及鉴定
            3.1.2.1 小鼠pIgR(mpIgR)的结构特点
            3.1.2.2 mpIgR的原核表达
            3.1.2.3 大鼠抗mpIgR单克隆抗体的制备及鉴定
        3.1.3 小鼠Fcα/μR及pIgR的组织定位研究
            3.1.3.1 mFcα/μR及mpIgR的基因表达谱研究
            3.1.3.2 mFcα/μR及mpIgR在各脏器的免疫组织化学研究
        3.1.4 小鼠Fcα/μR及pIgR在小鼠B淋巴瘤细胞系T560的表达
            3.1.4.1 mFcα/μR在T560的基因表达
            3.1.4.2 mFcα/μR及mpIgR在T560的蛋白表达
    3.2 大鼠Fcα/μR的组织定位初步研究
        3.2.1 大鼠Fcα/μR在各脏器的基因表达
        3.2.2 大鼠Fcα/μR蛋白表达的免疫组织化学研究
            3.2.2.1 小鼠抗rFcα/μR单克隆抗体的筛选
            3.2.2.2 rFcα/μR的免疫组织化学研究
第四章 讨论
    4.1 对抗Fcα/μR单克隆和多克隆抗体的评价
    4.2 对抗mpIgR单克隆抗体的评价
    4.3 Fcα/μR和pIgR组织定位分析
        4.3.1 基因表达谱分析
            4.3.1.1 小鼠Fcα/μR和pIgR的基因表达谱分析
            4.3.1.2 大鼠Fcα/μR及其他IgA受体的基因表达谱分析
        4.3.2 蛋白表达的组织定位分析
            4.3.2.1 小鼠Fcα/μR及pIgR在小鼠各脏器中的蛋白表达分析
            4.3.2.2 大鼠Fcα/μR在大鼠各脏器中的蛋白表达分析
    4.4 小鼠Fcα/μR及pIgR在小鼠B淋巴瘤细胞系T560的表达
综述:pIgR——粘膜免疫中的"Mr.Key"
参考文献
附录Ⅰ:质粒载体图谱和多克隆位点
附录Ⅱ:攻读博士学位期间文章发表情况
致谢



本文编号：4012265