基因工程乙肝表面抗原的表达、纯化及应用

发布时间：2025-01-15 19:16

　　乙型肝炎(Hepatitis B,HB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)引起的世界范围的传染性疾病,其囊膜蛋白乙肝表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)能够诱导机体产生保护性抗体乙肝表面抗体(Hepatitis B surface antibody,HBsAb),是乙肝疫苗的主要成分。同时,HBsAg也是ELISA诊断免疫是否成功的主要试剂成分。大量制备HBsAg在预防和检测方面有重要意义。本实验开展了HBsAg的体外表达及表达后初步纯化、应用的研究工作。 从已确诊的乙肝病人血清中提取DNA,利用Primer 5.0,参照GeneBank发表的序列,设计针对编码HBsAg S基因的特异性引物。PCR扩增S基因,将其分别克隆入毕赤酵母胞内表达载体pPICZB和分泌型表达载体pPICZaA中,成功构建了重组质粒pPICZS和pPICZaS。构建的重组子经SacI线性化后,电转化入酵母菌株GS115。利用抗生素Zeocin筛选重组子,诱导表达后,进行Western-blot,ELISA鉴定。结果表明,...

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
缩略语表
第一章 综述
    1. 乙型肝炎及其流行病学
    2. 乙型肝炎病毒
        2.1 乙肝病毒发现史
        2.2 乙肝病毒的分子生物学特征
        2.3 HBV感染的机理
    3. 乙肝表面抗原
        3.1 乙肝表面抗原的存在形式
        3.2 乙肝表面抗原的特征
        3.3 乙肝表面抗原的作用
    4. 基因工程 HBsAg的制备
        4.1 大肠杆菌表达系统
        4.2 酵母表达系统
        4.3 哺乳动物细胞表达系统
        4.4 病毒表达系统
        4.5 植物表达系统
    5. 立题背景及意义
第二章 乙肝表面抗原在毕赤酵母中的表达
    1. 材料
        1.1 菌株和表达载体
        1.2 常用的材料与试剂
        1.3 主要试剂配方
        1.4 仪器和设备
    2. 实验方法
        2.1 病毒 DNA模板的获取
        2.2 引物设计与合成
        2.3 PCR扩增 HBVS基因
        2.4 E.coli感受态细胞的制备(CaCl₂法)
        2.5 真核表达载体的构建
        2.6 电转化酵母感受态细胞的制备
        2.7 真核表达载体的线性化
        2.8 真核表达载体的电转化
        2.9 重组酵母菌表型的筛选
        2.10 重组酵母菌的鉴定
    3. 实验结果
        3.1 重组质粒的构建策略
        3.2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果
        3.3 重组质粒的酶切鉴定
        3.4 重组质粒的测序分析
        3.5 重组质粒的线性化结果
        3.6 SDS-PAGE分析表达结果
        3.7 Western-blot分析表达结果
        3.8 ELISA分析表达结果
    4. 讨论
第三章 乙肝表面抗原在原核表达系统(大肠杆菌)中的表达
    1. 材料
        1.1 菌株和表达载体
        1.2 常用的材料与试剂
        1.3 主要试剂配方
        1.4 仪器和设备
    2. 实验方法
        2.1 引物设计与合成
        2.2 PCR扩增HBVS基因
        2.3 原核重组质粒pRSETBS的构建
        2.4 重组工程菌的构建和诱导表达
        2.5 表达产物的鉴定
    3. 实验结果
        3.1 重组质粒的构建策略
        3.2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果
        3.3 重组质粒pRSETBS的酶切鉴定
        3.4 重组质粒的测序分析
        3.5 SDS-PAGE分析表达结果
        3.6 Western-blot分析表达结果
    4. 讨论
第四章 毕赤酵母表达乙肝表面抗原的纯化及应用
    1. 材料
        1.1 菌株
        1.2 常用的材料与试剂
        1.3 主要试剂配方
        1.4 仪器和设备
    2. 实验方法
        2.1 GS115-pPICZS最佳收获时间的确定
        2.2 GS115-pPICZS表达量的粗略确定
        2.3 GS115-pPICZS大量诱导表达
        2.4 Ni-NTA亲和层析纯化
        2.5 SDS-RAGE后银染分析
        2.6 Western-blot分析纯化后蛋白的活性
        2.7 Bradford法测纯化后蛋白的浓度
        2.8 纯化蛋白的应用
    3. 实验结果
        3.1 最佳收获时间的确定
        3.2 表达量的粗略估算
        3.3 银染分析 Ni-NTA 纯化的目的蛋白
        3.4 Western-blot分析纯化蛋白
        3.5 Bradford法测纯化蛋白的浓度
        3.6 纯化蛋白的应用
    4. 讨论
小结
参考文献
致谢



本文编号：4027735