PrxI在大鼠肾缺血再灌注损伤模型肝内的表达变化

发布时间：2017-05-30 03:00

  本文关键词：PrxI在大鼠肾缺血再灌注损伤模型肝内的表达变化，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肾脏是人体内主要的分泌排泄器官,它不仅参与代谢废物排泄、激素分泌,还可以维持水电解质以及酸碱平衡。有研究表明:当肾脏功能受损时,其邻近和远端器官如:心、肺、肝、肠和脑等的功能也会严重受损。肾缺血再灌注损伤(Renal ischemia reperfusion injury,RIRI)是一种常见的病理生理现象,多见于高血压、肾外科手术期间等,它也是导致肾移植后功能恢复延迟、病人愈后较差、甚至肾功能衰竭的重要因素。有研究表明:氧化应激是导致RIRI发生的主要病理机制之一。缺血再灌注时肾脏处于高度氧化应激状态,会有大量活性氧族(reactive oxygen species,ROS)产生。ROS包括超氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH-)和过氧化氢(H2O2)等;ROS化学性质非常活泼,可以破坏细胞内的蛋白质、DNA和脂类等生物大分子,从而影响细胞功能,甚至引起细胞和组织死亡。Peroxiredoxin(Prx)蛋白是近几年发现的一类过氧化物酶系,广泛存在于各种原核和真核生物细胞中。到目前为止,在哺乳动物中共找到6个家族成员,Prx I是其成员之一,在肝脏表达最高,主要负责还原过氧化物或超氧化物,保护细胞和组织免遭氧化应激损伤,在清除ROS中具有重要作用。肝脏也是人体内的重要器官之一,它不仅参与多种营养物质的代谢反应,还具有分泌、解毒、排泄等重要功能。当肾脏缺血再灌注损伤发生并产生大量ROS的同时,是否会使邻近器官肝脏也遭受氧化应激损伤?抗氧化酶Prx I的基因和蛋白表达水平又如何改变?均未见报道。本研究通过采用无损伤动脉夹钳夹肾动脉法建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型。24小时后观察血清ALT含量、肝脏组织的形态学改变,肝脏内MDA含量,Prx I基因水平和蛋白水平的表达变化,探讨肾脏缺血再灌注损伤时肝脏的功能和形态学改变,过氧化损伤程度,Prx I在缺血再灌注损伤过程中的抗氧化作用,为防治RIRI引起的肝脏损伤提供一条新思路。目的:观察大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型肝内的氧化应激状态和抗氧化酶Prx I基因和蛋白水平的表达变化,探讨Prx I在RIRI诱发的肝脏过氧化损伤中的作用。方法:1肾脏缺血再灌注损伤模型的制备及取材雄性Wister大鼠12只,体重200±10 g,购于河北医科大学实验动物中心,随机分为对照组(Control)和肾脏缺血再灌注损伤组(RIRI),每组各6只。用6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(5ml/kg),参照余晓东等人的方法制备肾脏缺血再灌注损伤模型。RIRI组大鼠开腹后暴露其双侧肾脏,先切除右肾,然后钝性分离左肾动脉,在靠近肾门处用无创动脉夹夹闭左肾动脉,观察肾脏由鲜红色逐渐变为暗红色。45 mins后松开动脉夹,恢复血液供应,肉眼可见肾动脉充盈,肾脏由暗红色迅速变为鲜红色,表明再灌注成功。对照组大鼠开腹后只切除右肾,分离左肾动脉,但不夹闭左肾动脉。24小时后收集血液,3000rpm离心10min,分离血清用于血清肌酐(Serum Creatinine,SCr)、血尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN),丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase,ALT)浓度测定;处死大鼠取肾脏和肝脏,一部分4%多聚甲醛中固定进行HE染色,观察肾脏和肝脏的形态学改变。一部分肝脏置于液氮中用于Prx I m RNA和蛋白水平测定以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量测定。2测定指标及方法2.1血清ALT、SCr和BUN水平测定血清ALT水平由全自动生化分析仪测定;血清SCr浓度采用苦味酸法测定;血清BUN浓度采用酶偶联速率法测定。2.2 HE染色观察大鼠肾脏和肝脏的形态结构肾脏和肝脏组织经常规脱水、透明,石蜡包埋后,切片厚约5μm,苏木精伊红染色,日本产Olympus光学显微镜下观察肝组织和肾脏的形态变化并进行图象分析。2.3大鼠肝组织MDA含量测定将从-70℃冰箱中取出的肝组织按照10mg/100μl加入预冷的匀浆缓冲液(50mmol/L磷酸钾缓冲液,PH7.4,1mmol/L盐酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巯基乙醇),冰浴中匀浆,匀浆液4000rpm 4℃离心20min,取上清即制成10%肝组织匀浆,肝组织匀浆内MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)测定试剂盒测定。2.4大鼠肝组织Prx I m RNA水平测定用TRIzol法提取肝内总RNA。约3μg总RNA反转录成c DNA。以GAPDH为内对照,进行RT-PCR。分别以Prx I的扩增产物与GAPDH灰度值之比表示目的基因的相对表达量2.5大鼠肝组织Prx I蛋白水平测定采用Western blot法测定大鼠肝组织Prx I蛋白水平。将大鼠肝组织制成匀浆,离心后取上清。用改良Lowry法进行蛋白总量测定.电泳的蛋白上样量为58 ug.经过转膜和封闭处理后,在PVDF膜上加入兔抗Prx I抗体,室温静置过夜。再加入荧光标记的抗兔Ig G抗体.在双色红外线成像系统扫描照相并进行图像数值分析。结果:1大鼠肾组织和肝组织的形态学改变光学显微镜下可见正常组大鼠肾血管球、肾小囊、近曲小管、远曲小管及集合管形态结构清晰规整。而RIRI组大鼠可见肾血管球萎缩,体积变小;肾小囊腔扩张;肾小管管腔明显扩张,个别近曲小管上皮细胞水肿,胞浆疏松化;肾间质水肿,肾小管间隙扩大;集合管出现管腔扩张、上皮水肿等改变。对照组大鼠肝细胞索排列整齐、染色均匀,未见异常;RIRI组大鼠肝细胞索排列欠整齐、染色较对照组浅、肝血窦略有扩张。2血清ALT水平Con组大鼠血清中ALT活性为19.8±3.76U/L,而RIRI组血清ALT活性为64.3±7.92 U/L。RIRI组大鼠血清ALT活性明显高于Con组(P0.01)。3血清SCr水平Con组大鼠血清中SCr的浓度为103.444±8.465μmol/L,而RIRI组血清SCr的浓度为131.153±17.814μmol/L。RIRI组大鼠血清SCr浓度明显高于Con组(P0.05)。4血清BUN水平Con组大鼠血清BUN的浓度为4.462±0.541 mmol/L,而RIRI组血清BUN的浓度为13.685±4.397 mmol/L。RIRI组大鼠血清BUN的浓度明显高于Con组(P0.05)。5肝浆内MDA的含量Con组大鼠肝匀浆内的MDA含量为9.03±2.11mmol/g,而RIRI组肝匀浆内的MDA含量为16.12±1.89 mmol/g。RIRI组大鼠肝匀浆内的MDA含量明显高于Con组(P0.01)。6肝组织Prx I m RNA的相对表达量采用RT-PCR的方法测定大鼠肝组织内Prx I m RNA的相对表达量。Con组肝组织内Prx I m RNA的相对表达量为0.75±0.18,RIRI肝组织内Prx I m RNA的相对表达量为1.23±0.21,RIRI组大鼠肝组织内Prx I m RNA水平明显高于Con组(P0.01)。说明RIRI组大鼠肝组织内Prx I的基因表达水平升高。7大鼠肝组织Prx I蛋白水平Con组大鼠肝组织内Prx I的蛋白表达水平为0.69±0.13,RIRI组大鼠肝组织内Prx I的蛋白表达水平为1.04±0.16。RIRI组Prx I蛋白水平明显高于对照组(P0.01)。说明RIRI组大鼠肝组织内Prx I的蛋白表达水平升高。结论:1切除右肾后在靠近肾门处用无创动脉夹夹闭左肾动脉可成功建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型。2肾脏缺血再灌注损伤可使邻近器官肝脏遭受氧化应激损伤,形态结构和功能受损。3 Prx I的基因和蛋白表达水平在RIRI模型肝脏中明显增强。提示Prx I可能参与了缺血再灌注所诱发的氧化应激反应,对肝细胞具有保护功能。
【关键词】：缺血再灌注损伤 PrxI MDA ALT 氧化应激
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692;R-332
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-14
• 英文缩写14-15
• 前言15-16
• 材料与方法16-24
• 结果24-26
• 附图26-33
• 附表33-36
• 讨论36-37
• 结论37-38
• 参考文献38-40
• 综述 应激的研究进展40-51
• 参考文献46-51
• 致谢51-52
• 个人简历52

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