鼠疫耶尔森氏菌降解其分泌的鼠毒素研究

发布时间：2017-06-02 17:01

  本文关键词：鼠疫耶尔森氏菌降解其分泌的鼠毒素研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)引起的一种自然疫源性烈性传染病,历史上曾发生过三次人间鼠疫大流行引起数以亿计的人死亡,给人类带来巨大的灾难。鼠疫在我国被规定为甲类传染病,我国鼠疫自然疫源地分布广泛,占国土面积的15%左右,且疫区动物鼠疫流行面积不断扩大,人间鼠疫病例呈上升态势。此外,鼠疫菌又是一种生物战剂和恐怖剂,威胁着人类的安全。因此鼠疫的防治对人民健康安全、经济发展和社会稳定依然具有重要意义。毒力完整的鼠疫菌含有三个毒力质粒(p CD1、p MT1、p PCP1),其中p CD1质粒被认为是鼠疫菌增殖扩散发挥毒力作用最主要的毒力质粒,其编码的T3SS将Yops蛋白 注射‖到宿主细胞中,通过干扰细胞的正常生理功能、抑制免疫反应导致宿主死亡。p MT1质粒主要编码了鼠毒素,是鼠疫菌在跳蚤中肠生存形成菌栓[1]的重要因素,在鼠疫菌传播中发挥重要作用。p PCP1质粒主要编码pla基因,Pla蛋白具有蛋白水解酶活性,并且可以降解Yops蛋白,是导致鼠疫菌高侵袭性的重要因素[2,3]。故p MT1、p PCP1质粒在鼠疫菌传播和扩散的过程中也起到了非常重要的作用。在前期工作中,我们使用一株自内蒙古分离的布氏田鼠(Microtus brandii)型鼠疫菌201株,它含有p PCP1质粒、p CD1质粒、p MT1质粒和p CRY质粒。本室倪斌博士以鼠疫菌201株为母本,采用质粒无痕消除的策略,对4个质粒进行了不同程度的消除,获得了不同质粒缺失的突变株[4](201-p PCP1+p CD1+p MT1+、201-p PCP1+p MT1+、201-p PCP1+p CD1+、201-p CD1+p MT1+、201-p CD1+、201-p PCP1+、201-p MT1+、201-p)。通过各质粒缺失株小鼠攻毒实验,我们发现高剂量下只含有p MT1质粒的菌株(201-p MT1+)对小鼠表现出异常的毒力,这与p MT1质粒不含重要的毒力因子的结论不吻合。通过对各质粒缺失株进行SDS-PAGE电泳分析,结果显示所有含p MT1质粒的菌株(201-p PCP1+p CD1+p MT1+、201-p PCP1+p MT1+、201-p CD1+p MT1+、201-p MT1+)菌体中均有Ymt条带,其中含p MT1质粒且含p PCP1质粒的菌株(201-p PCP1+p CD1+p MT1+、201-p PCP1+p MT1+)的培养上清中检测不到Ymt条带,但可以检测到Ymt的降解片段;含p MT1质粒且不含p PCP1质粒的菌株(201-p CD1+p MT1+、201-p MT1+)的培养上清中可以检测到Ymt条带。一直以来Ymt被公认为是一种胞内蛋白,本实验首次在p PCP1质粒缺失株的分泌上清中检测到它,提示鼠疫菌分泌的Ymt可能在分泌过程中被p PCP1质粒所降解。为了进一步探究Ymt蛋白是否是在分泌过程中被降解?被哪些基因降解?是否是直接降解?我们利用Red重组系统,采用一步法基因突变技术,构建了pla敲除株(201-p CD1+-p MT1+-p PCP1+-Δpla、201-p MT1+-p PCP1+-Δpla);利用可以在鼠疫菌内复制,并且拷贝数与鼠疫菌质粒相近的p ACYC184质粒,构建了pla回补株(201-p CD1+-p MT1+-p PCP1+-Δpla-p ACYC184-pla、201-p MT1+-p PCP1+-Δpla-p ACYC184-pla),基于构建成功的pla敲除株和pla回补株,将二者的分泌上清进行了SDS-PAGE电泳和WB验证,结果均显示敲除了pla的鼠疫菌(201-p CD1+-p MT1+-p PCP1+-Δpla、201-p MT1+-p PCP1+-Δpla)的分泌上清中可以检测到Ymt蛋白,而pla回补株(201-p CD1+-p MT1+-p PCP1+-Δpla-p ACYC184-pla、201-p MT1+-p PCP1+-Δpla-p ACYC184-pla)的分泌上清中检测不到Ymt蛋白,但可以检测到Ymt蛋白的降解片段,证明p PCP1质粒编码的pla降解了Ymt蛋白。为了进一步验证我们的发现,体外构建了BL21-p ET28a-pla、BL21-p ET28a-ymt获得体外表达纯化的Pla蛋白和Ymt蛋白,并对纯化后的Pla蛋白和Ymt蛋白进行了生物活性测定,证明二者均有活性。其中,重点测定了Ymt蛋白对小鼠的毒性,首次观察了纯化Ymt蛋白对小鼠脏器的病理学损伤。将纯化后的Pla蛋白和Ymt蛋白在离体37℃条件下孵育,孵育后的混合蛋白液进行SDS-PAGE电泳,结果显示混合蛋白液中只有Ymt蛋白没有Ymt蛋白的降解片段,故纯化后的Pla不能降解Ymt蛋白。我们将重组质粒p ACYC184-pla导入到只含有染色体基因而不含质粒的鼠疫菌中构建重组菌株(P?-p ACYC184-pla),将重组菌株(P?-p ACYC184-pla)与纯化的Ymt蛋白37℃孵育,上清进行SDS-PAGE电泳。构建重组菌株(E.coli K12-p ACYC184-pla、E.coli K12-p ET28a-pla),重组后的菌株实验同上。SDS-PAGE电泳结果显示两株重组菌株与Ymt蛋白孵育后的上清中无Ymt条带,检测到Ymt降解片段,进一步证明在没有其他鼠疫菌质粒存在的情况下、无鼠疫菌菌体内参与的情况下,Pla蛋白可以降解Ymt蛋白。本研究首次证明Ymt蛋白是分泌蛋白,并且Ymt蛋白在分泌过程中可以被p PCP1质粒编码的pla所降解。研究过程中没有检测到纯化后的Pla蛋白降解Ymt蛋白,我们推测可能是由于Pla降解Ymt还需要借助于其他因子,也可能是Pla蛋白需要特殊的空间结构才发挥作用,或者Pla降解Ymt蛋白存在一种特殊的机制。本研究结果为深入揭示鼠疫菌致病机制奠定了基础,也为鼠疫菌毒力进化的研究提供有力证据。
【关键词】：Ymt蛋白 Pla蛋白 鼠疫菌 鼠疫 降解作用
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要8-11
• Abstract11-14
• 缩略词14-15
• 前言15-21
• 1 鼠疫的爆发、流行及危害15-16
• 2 鼠疫菌的致病机制16
• 3 鼠疫菌的毒力因子16-19
• 3.1 鼠疫菌染色体上的毒力因子16-17
• 3.1.1 pgm位点16-17
• 3.1.2 p H6抗原17
• 3.1.3 脂多糖（LPS）17
• 3.1.4 Pho P/Q二元调控系统17
• 3.2 鼠疫菌质粒上的毒力因子17-19
• 3.2.1 p PCP1编码的毒力因子17-18
• 3.2.2 p MT1编码的毒力因子18
• 3.2.3 p CD1编码的毒力因子18-19
• 4 本研究的目的和意义19
• 5 本研究的内容19-21
• 第一章 鼠疫菌pla缺失株互补株的构建和验证21-31
• 1 引言21-22
• 2 材料与方法22-27
• 2.1 材料22
• 2.1.1 菌株和质粒22
• 2.1.2 主要试剂22
• 2.1.3 主要仪器22
• 2.2 方法22-27
• 2.2.1 回补株构建22-25
• 2.2.2 回补株验证25-27
• 3 结果与讨论27-30
• 3.1 pla基因回补株的构建27-28
• 3.2 蛋白电泳、WB验证回补后pla功能28-30
• 4 结论30-31
• 第二章 鼠疫菌Pla蛋白的体外表达纯化31-40
• 1 引言31
• 2 材料与方法31-35
• 2.1 材料31-33
• 2.1.1 菌株和质粒31
• 2.1.2 主要试剂31-32
• 2.1.3 主要仪器32
• 2.1.4 纯化重组蛋白使用溶液的配置32-33
• 2.2 方法33-35
• 2.2.1 表达载体的构建33-34
• 2.2.2 蛋白的表达34
• 2.2.3 蛋白的变性与复性34-35
• 2.2.4 Western印迹鉴定目的蛋白35
• 2.2.5 Pla纤溶酶原激活剂的活性测定35
• 3 结果与讨论35-39
• 3.1 pla基因片段的扩增及重组载体的鉴定35-36
• 3.2 Pla蛋白的诱导表达36-37
• 3.3 Pla蛋白的变性与复性37-38
• 3.4 Pla蛋白活性测定38-39
• 4 结论39-40
• 第三章 鼠疫菌Ymt蛋白的体外表达纯化40-52
• 1 引言40
• 2 材料与方法40-44
• 2.1 材料40-41
• 2.1.1 菌株与质粒40
• 2.1.2 主要试剂40-41
• 2.1.3 主要仪器41
• 2.1.4 蛋白纯化试剂41
• 2.1.5 实验动物41
• 2.2 方法41-44
• 2.2.1 表达载体的构建41-42
• 2.2.2 蛋白表达42
• 2.2.3 蛋白的纯化42-43
• 2.2.4 Western印迹鉴定目的蛋白43
• 2.2.5 Ymt活性的测定43-44
• 3 结果与讨论44-50
• 3.1 克隆、诱导表达Ymt44
• 3.2 Ymt蛋白的纯化44-45
• 3.3 重组Ymt蛋白在小鼠体内LD50的测定45-48
• 3.4 Ymt引起小鼠组织病理损伤48-49
• 3.5 Ymt的 β-肾上腺素能阻断活性49-50
• 4 讨论50-52
• 第四章 鼠疫菌Pla蛋白与Ymt蛋白相互作用52-59
• 1 引言52
• 2 材料与方法52-54
• 2.1 材料52-53
• 2.1.1 菌株与质粒52-53
• 2.1.2 主要试剂53
• 2.1.3 主要仪器53
• 2.2 方法53-54
• 2.2.1 pla与ymt直接反应53
• 2.2.2 胞内表达重组Pla蛋白与Ymt的相互作用53-54
• 2.2.3 突变失活后的Pla蛋白与Ymt的相互作用54
• 3 结果与讨论54-58
• 3.1 外源提供LPS环境中Pla蛋白与Ymt蛋白的相互作用54
• 3.2 胞内表达重组Pla蛋白与Ymt的相互作用54-57
• 3.3 突变失活后的Pla蛋白与Ymt的相互作用57-58
• 4 结论58-59
• 参考文献59-63
• 附录63-67
• 主要仪器63-64
• 常用试剂及配制方法64-65
• 个人简历65-66
• 在学期间的研究成果目录66
• 承担课题66-67
• 致谢67-69
• 综述69-73
• 参考文献73-74

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5 贺雄 北京市疾控中心副主任 夏连续 刘汀;鼠疫来临科学防控不恐慌[N];中国中医药报;2009年

6 本报记者 金振娅;严防鼠疫[N];光明日报;2010年

7 杨顺义;鼠疫与旅行[N];中国国门时报(中国出入境检验疫报);2002年

8 自治区地方病防治研究所供稿;提高防护意识 消除鼠疫危害[N];西藏日报;2003年

9 崔尚金;聚焦老而不朽的人畜共患病：鼠疫[N];中国畜牧兽医报;2005年

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9 陈双艳;一株大肠杆菌O104的表型及基因型鉴定[D];大理学院;2013年

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