孕酮对AD细胞模型及动物模型tau蛋白过度磷酸化的影响及机制探讨

发布时间：2017-06-13 15:15

  本文关键词：孕酮对AD细胞模型及动物模型tau蛋白过度磷酸化的影响及机制探讨，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:tau蛋白过度磷酸化形成神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)是阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)的病理核心机制之一。研究表明,诸多因素都能够引起tau的异常磷酸化,其中,最具有研究意义的是β-样淀粉蛋白(Aβ)。研究表明,PI3K/AKt-GSK-3β信号通路是调节tau蛋白磷酸化的主要通路之一。孕酮(Progesterone,PROG),在临床上多被用于治疗女性生殖系统的疾病,其实它也是一种在大脑内起关键作用的内源性神经甾体。研究表明,孕酮可以通过抑制神经细胞兴奋性毒性、改善AD动物模型学习记忆功、抑制神经元凋亡等方面发挥神经保护作用。本研究采用Aβ活性片断Aβ25-35作用于原代培养的大鼠神经元建立AD细胞模型、以APP/PS1转基因小鼠为AD动物模型,分别研究了孕酮在细胞水平和动物水平对神经元内tau蛋白过度磷酸化的影响及相关机制。方法:1皮层神经元的原代培养将新生24 h内的SD大鼠,超净台内取皮质部分,用1.25 g/L胰酶消化;加入含10%FBS的DMEM完全培养液终止消化,接种于细胞培养板中,细胞密度为1.0×109/L,5%CO2和37℃条件下静置培养。4 h后换为neurobasal完全培养液(100 ml加B27 2 m1),48 h后加入阿糖胞苷(终浓度5μg/ml)阻止胶质细胞共同生存;共培养8~10 d。2凝聚态Aβ25-35的制备将Aβ25-35冻干粉溶解于无菌双蒸水配制成终浓度为1 mmol/L的储备液,混匀、分装,于37℃无菌环境放置3 d,使其老化、凝聚。3 d后取出,于-20℃冻存、备用。3实验分组3.1 Aβ25-35对神经元tau蛋白过度磷酸化的影响将神经元随机分为Control、Aβ25-35(20μM、40μM),共同培养24h。采用western blot法检测p-tau(Ser404)和p-tau(Thr231)的蛋白表达。3.2孕酮对Aβ25-35引起的神经元tau蛋白过度磷酸化的影响将神经元随机分为Control、Aβ25-35(20μM)、Aβ25-35+PROG(1μM),共同培养24 h。采用western blot法和免疫荧光化学技术检测p-tau(Ser404)和p-tau(Thr231)的蛋白表达。3.3孕酮对APP/PS1转基因小鼠脑内tau蛋白过度磷酸化的作用及机制研究将APP/PS1转基因小鼠随机分为两组:APP/PS1模型组和PROG治疗组,每组6只。PROG治疗组:于颈部皮下部位给予孕酮,连续注射5d,休息2 d,继续注射,如此循环一个月。APP/PS1模型组:注射同等计量的生理盐水。采用免疫组织荧光化学法检测p-tau(Ser404)、p-tau(Thr231)、p-GSK-3β(Tyr216)和p-AKt(Ser473)的蛋白表达。3.4孕酮对Aβ25-35引起的神经元内GSK-3β的影响将神经元随机分为Control、Aβ25-35、Aβ25-35+PROG、Aβ25-35+Li Cl(5m M,GSK-3β特异性抑制剂),共同培养24 h。采用western blot法检测p-tau(Ser404)、p-tau(Thr231)和p-GSK-3β(Tyr216)的蛋白表达。3.5孕酮对Aβ25-35引起的神经元内PI3K/AKt的影响将神经元随机分为Control、Aβ25-35、Aβ25-35+PROG、Aβ25-35+PROG+LY294002(10μM,PI3K/AKt特异性抑制剂),共同培养24 h。采用western blot法检测p-tau(Ser404)、p-tau(Thr231)、p-GSK-3β(Tyr216)和p-AKt(Ser473)的蛋白表达。3.6 PGRMC1在孕酮抑制tau蛋白过度磷酸化过程中的作用将神经元随机分为Control、Aβ25-35、Aβ25-35+PROG、Aβ25-35+PROG+AG205(5μM,PROG膜受体抑制剂)、Aβ25-35+PROG+RU486(5μM,PROG核受体抑制剂),共同培养24 h。采用western blot法检测p-tau(Ser404)、p-tau(Thr231)的蛋白表达。3.7 PGRMC1对PI3K/AKt-GSK-3β信号通路的影响将神经元随机分为Control、Aβ25-35、Aβ25-35+PROG、Aβ25-35+PROG+AG205,共同培养24 h。采用western blot法检测p-GSK-3β(Tyr216)和p-AKt(Ser473)的蛋白表达。4 Western Blot法检测p-tau(Ser404)、p-tau(Thr231)、T-tau、p-GSK-3β(Tyr216)、p-AKt(Ser473)、T-GSK-3β、T-AKt的表达收集各组细胞,提取总蛋白,用BCA法定量。以SDS-PAGE电泳分离,湿转法转膜,脱脂奶粉封闭,加入用脱脂奶粉稀释的一抗(p-Tau[Ser404],p-Tau[Thr231],T-tau,p-GSK-3β[Tyr216],T-GSK-3β,p-AKt[Ser473],T-AKt,1:1000稀释),4℃孵育过夜,加入二抗反应2 h。显色、X光片曝光。扫描胶片,应用Image J图像分析软件对条带进行定量分析。5免疫荧光细胞化学检测神经元内p-tau(Ser404)、p-tau(Thr231)的表达PBS清洗玻片上的细胞,4%多聚甲醛固定,0.05%Triton-X100打孔,再用3%的BSA封闭;将细胞按比例加入一抗:(p-Tau[Ser404],1:200稀释,p-Tau[Thr231],1:200稀释),4℃孵育过夜;加入二抗,在37℃黑暗环境孵育2 h。最后用荧光显微镜观察。6免疫组织荧光化学检测APP/PS1转基因小鼠脑内p-tau(Ser404)、p-tau(Thr231)、p-GSK-3β(Tyr216)、p-AKt(Ser473)的表达待小鼠8月龄时,将小鼠麻醉、取脑,置于4%多聚甲醛中固定,备用;将切好的脑片用山羊血清封闭液封闭30 min,按比例加入一抗:(p-Tau[Ser404],p-Tau[Thr231],p-GSK-3β[Tyr216],p-AKt[Ser473],1:200稀释),4℃孵育过夜;加入二抗,避光孵育2 h,Hoechst33258染色5 min;荧光显微镜观察。7数据处理与统计分析应用SPSS 16.0统计软件处理数据,实验数据以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验。结果以P0.05视为差异有统计学意义。结果:1 Aβ25-35对神经元tau蛋白过度磷酸化的影响Western blot结果显示:与Control组相比,20、40μM Aβ25-35均能引起大鼠皮质神经元内p-tau(Thr231)、p-tau(Ser404)蛋白表达水平显著性升高(P0.05)。T-tau未见显著性变化。但考虑到Aβ25-35的毒性,故选择20μM Aβ25-35诱导神经元作为AD细胞模型。2孕酮对Aβ25-35引起的神经元内tau蛋白过度磷酸化的影响Western blot结果显示:与Aβ25-35损伤组相比,PROG保护组p-tau(Thr231)、p-tau(Ser404)蛋白表达水平显著降低(P0.05)。免疫荧光化学结果显示:与Control组相比,Aβ25-35损伤组神经元内的p-tau(Thr231)、p-tau(Ser404)蛋白在胞浆明显表达,胞核无着色(P0.05);与Aβ25-35损伤组相比,PROG保护组p-tau(Thr231)、p-tau(Ser404)蛋白着色显著降低(P0.05)。3孕酮对APP/PS1转基因小鼠皮层、海马tau蛋白磷酸化水平的影响免疫荧光化学结果显示:APP/PS1转基因小鼠脑区皮层、海马神经元内p-tau(Thr231)、p-tau(Ser404)蛋白显著着色;与APP/PS1转基因小鼠相比,经孕酮治疗后的小鼠脑区p-tau(Thr231)、p-tau(Ser404)的蛋白表达水平显著降低(P0.05)。4孕酮对Aβ25-35引起的神经元GSK-3β的影响Western blot结果显示:与Aβ25-35损伤组相比,PROG保护组和Li Cl处理组均能引起p-tau(Thr231)、p-tau(Ser404)蛋白表达显著降低(P0.05),以及p-GSK-3β表达的显著降低(P0.05)。5孕酮对Aβ25-35引起的神经元PI3K/AKt的影响Western blot结果显示:与Control组相比,Aβ25-35损伤组能够引起p-AKt蛋白表达显著性降低(P0.05);与Aβ25-35损伤组相比,PROG保护组能够引起p-AKt蛋白表达显著性升高(P0.05);与PROG保护组相比,LY294002处理组p-tau(Thr231)、p-tau(Ser404)蛋白表达显著升高(P0.05)。6 PGRMC1在孕酮抑制tau蛋白过度磷酸化过程中的作用Western blot结果显示:与PROG保护组相比,AG205处理组能够显著增加p-tau(Thr231)、p-tau(Ser404)的蛋白表达(P0.05),而RU486处理组没有引起tau蛋白磷酸化位点的显著变化。7 PGRMC1对PI3K/AKt-GSK-3β通路的影响Western blot结果显示:与PROG保护组相比,AG205组能够显著增加p-GSK-3β的蛋白表达(P0.05);同时,AG205组显著降低了p-AKt的蛋白表达(P0.05)。8孕酮对APP/PS1转基因小鼠脑区GSK-3β的影响免疫荧光化学结果显示:APP/PS1转基因小鼠脑区神经元内p-GSK-3β显著着色;与APP/PS1转基因小鼠相比,经孕酮治疗后的小鼠脑区p-GSK-3β的表达量显著降低(P0.05)。9孕酮对APP/PS1转基因小鼠脑区PI3K/AKt通路的影响免疫荧光化学结果显示:APP/PS1转基因小鼠脑区神经元内p-AKt着色不明显;与APP/PS1转基因小鼠相比,经孕酮治疗后的小鼠脑区p-AKt的表达量显著升高(P0.05)。结论:1孕酮能够抑制Aβ25-35引起的原代培养大鼠皮质神经元以及APP/PS1转基因小鼠脑区内tau蛋白过度磷酸化。2孕酮对Aβ25-35引起的神经元内及APP/PS1转基因小鼠脑区tau蛋白过度磷酸化的抑制作用可能是通过调节PI3K/AKt-GSK-3β通路完成的。3 PGRMC1可能介导了孕酮抑制神经元tau蛋白过度磷酸化以及调节PI3K/AKt-GSK-3β通路的作用。
【关键词】：阿尔茨海默病 孕酮 β-淀粉样蛋白 tau蛋白过度磷酸化 PI3K/AKt-GSK-3β信号通路 PGRMC1 神经保护
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16;R-332
【目录】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-15
• 英文缩写15-16
• 引言16-18
• 第一部分 孕酮对AD细胞模型及动物模型tau蛋白过度磷酸化的影响18-35
• 前言18-19
• 材料与方法19-24
• 结果24-25
• 附图25-29
• 附表29-30
• 讨论30-31
• 小结31-32
• 参考文献32-35
• 第二部分 孕酮抑制AD细胞模型及动物模型tau蛋白过度磷酸化的机制研究35-52
• 前言35-36
• 材料与方法36-39
• 结果39-40
• 附图40-46
• 讨论46-48
• 小结48-49
• 参考文献49-52
• 结论52-53
• 综述 关于tau蛋白在阿尔茨海默病中的研究现状53-66
• 参考文献60-66
• 致谢66-67
• 个人简历67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：446896