磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板的研制及HBV抗原特异性T细胞的初步检测

发布时间：2017-06-14 01:01

  本文关键词：磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板的研制及HBV抗原特异性T细胞的初步检测，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：抗原特异性T细胞在机体抗感染、抗肿瘤以及自身免疫性疾病等方面发挥着至关重要的作用,其数量的多少和功能的强弱直接反映了人体特异性细胞免疫的功能状态。所以抗原特异性T淋巴细胞的动态监测在发病机制研究、治疗方案选择和疗效观察以及疫苗效果监测等方面都有着重要的参考价值。近20年来,抗原特异性T细胞的检测方法有了快速发展,从最初的Cr5’释放法、有限稀释法和胞内细胞因子染色法发展到了现在的金标准——pMHC多聚体荧光染色及流式分析法,最具特异性和准确性。但是目前临床上依然很少对患者进行抗原特异性T细胞数量和功能的监测,原因是pMHC多聚体价格昂贵,需要流式细胞仪等特殊仪器；针对各种HLA基因型以及各种病原体抗原、肿瘤抗原或自身抗原的商品化pMHC多聚体非常缺乏,不成系列,难以满足对各种HLA基因型别的患者以及针对特定病原体的多种抗原表位特异性T细胞进行检测的实际需要；不能高通量地同步进行数量和功能的分析等。所以进一步探索操作简便、无需特殊仪器、能同步检测抗原特异性T细胞数量和功能的新方法相当重要。本课题组前期以直径为4.5 μm的磁珠为载体,包被进口的H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚体制备磁珠式人工抗原提呈细胞(aAPC-beads),在96孔板中同步检测OT-1鼠脾淋巴细胞群中OVA抗原特异性CD8+T细胞的数量和反应活性,建立了磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板技术(aAPC-microplate)并进行了方法学的评价,证明了该技术在无需特殊仪器条件下的可行性。为了进一步实现该技术的试剂盒化和国产化,本研究首先对pMHC多聚体制备技术进行改进,自制H-2Kb/OVA单链三聚体(SCT),验证其构象与功能；然后用该蛋白替代进口的昂贵商品制备aAPC-beads,建立aAPC-microplate,同步检测OVA抗原特异性CD8+ T细胞的数量和功能,重新进行方法学论证；最后利用aAPC-microplate技术初步检测慢性乙型肝炎患者外周血中HBV抗原特异性CD8+T细胞的数量,主要的结果如下：1、首次采用重叠延伸PCR和同源重组技术,无需限制性内切酶和连接酶,成功构建H-2Kb/OVA SCT匡组质粒,原核表达SCT蛋白,镍柱纯化,稀释复性折叠,继而通过链霉亲和素-生物素系统将生物素化的H-2Kb/OVA SCT蛋白包被磁珠,制备成H-2Kb/OVA SCT beads.通过H-2Kb构象特异性单抗荧光染色和流式分析验证了该SCT分子的正确空间构象；以该SCT分子为基础构建H-2Kb/OVA四聚体,流式检测OT-1鼠脾淋巴细胞群中OVA抗原特异性CD8+T细胞的比例,与进口的H-2Kb-Ig/OVA二聚体检测结果相似(38.09% vs.35.32%),提示其与特异性TCR的有效结合能力。2、利用H-2Kb/OVA SCT beads,在96孔反应板中对OVA抗原特异性CD8+ T细胞进行磁性分选和计数,然后补加ConA培养24h,通过酶联斑点实验检测OVA抗原特异性CD8+ T细胞群中分泌IFN-γ的细胞比例,作为其反应活性比。本实验设置5个细胞接种数量组,每个数量组设置3个复孔,阳性细胞数比例由复孔的平均值表示,并对5个检测数量组的平均比例进行直线回归方程校正。方法学的准确性分析显示：aAPC-beads在不同细胞数量孔中与靶细胞的结合以及在磁场下的分选呈现良好的数量依赖关系和线性关系,R2值均达0.99以上；特异性分析显示：aAPC-microplate分选后,阳性细胞群中OVA抗原特异性CD8+ T细胞的比例为92.35%和86.39%(两次实验结果)；重复性分析显示：在5个检测数量组之间,阳性细胞比例的平均分析内CV值为6.44%和4.01%；对同一份OT-1鼠脾淋巴细胞群进行三次重复实验时,分析间CV值为3.22%,符合生物制品鉴定标准；与经典的pMHC多聚体流式分析法相比：两种方法对5只OT-1鼠的检测结果经配对t检验无统计学差异,p=0.2397,回归分析显示两种检测方法的吻合度有统计学意义,两组结果有显著相关性,相关方程为Y=2.229+0.815X,相关系数r=0.983,P0.01。反应活性检测结果显示：2只OT-1鼠脾淋巴细胞群经aAPC-microplate分选后,OVA抗原特异性CD8+T细胞群的反应活性比分别为43.83%和41.87%。另外,传统ELISPOT检测OT-1鼠脾淋巴细胞群经OVA抗原肽刺激后分泌IFN-y的细胞比例分别为4.44%和4.01%,远低于aAPC-microplate方法和经典pMHC多聚体流式分析法的检测比例。3、利用课题组前期自制的HLA-A*0201/HBc18-27、A*0201/HBe183-191、A*0203/HBc18-27、 A*0203/HBe183-191和A*0206/HBc18-27五种单链三聚体蛋白,包被磁珠制成五种HLA-A2/HBV beads,利用aAPC-microp late方法对慢性乙肝患者PBMC中HBV抗原特异性CD8+ T细胞进行数量检测。初步结果有：运用流式分析和PCR-SBT方法对20余名慢性乙肝患者进行HLA-A2基因分型,得5例HLA-A2阳性患者。进口HLA-A2/HBV二聚体荧光染色和流式分析显示：HBc18-27和HBe183-191表位特异性CD8+ T细胞比例分别为0.15%、0.08%、0.25%、0.08%和0.28%:aAPC-microplate检测的相应比例为0.10%、0.11%、0.28%、0.10%和0.23%。配对t检验显示两组结果无统计学差异,p=0.9454,相关方程为Y=0.028+0.811X,相关系数r=0.893,P0.01。本研究首先利用新技术方案自制了H-2Kb/OVA单链三聚体蛋白,具有正确构象与功能；然后用其替代昂贵的进口商品建立aAPC-microplate方法,同步检测OT-1鼠中OVA抗原特异性T细胞数量和功能,完成了方法学论证,提示了技术的可行性；最后利用aAPC-microplale技术初步检测慢性乙型肝炎患者外周血中HBV抗原特异性CD8+T细胞的数量,结果与经典的进口HLA-A2/HBV多聚体流式分析法无统计学差异。本研究为下一步制备临床试剂盒奠定了基础。
【关键词】：抗原特异性T细胞 磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板 HBV
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 主要英文缩写词11-13
• 前言13-16
• 文献综述 基于pMHC复合体的抗原特异性T细胞检测技术的研究进展16-30
• 参考文献25-30
• 第一节 H-2K~b/OVA单链三聚体分子的构建、表达与验证30-47
• 引言30-31
• 1. 材料和试剂31-34
• 2. 方法34-42
• 3. 结果42-45
• 4. 讨论45-47
• 第二节 aAPC-microplate技术对OVA抗原特异性T细胞数量和功能的同步检测47-68
• 引言47-48
• 1. 材料和试剂48-49
• 2. 方法49-53
• 3. 结果53-66
• 4. 讨论66-68
• 第三节 aAPC-microplate技术初步检测HBV抗原特异性T细胞的数量68-80
• 引言68-69
• 1. 材料和试剂69-70
• 2. 方法70-74
• 3. 结果74-78
• 4. 讨论78-80
• 小结与展望80-81
• 参考文献81-84
• 致谢84-85
• 作者简介85

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