H2A去泛素化酶MYSM1在血管生成中的作用及其机制的初步研究

发布时间：2017-06-16 00:06

  本文关键词：H2A去泛素化酶MYSM1在血管生成中的作用及其机制的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景血管的发育和生成参与胚胎和个体发育的各个阶段,是多种细胞和多种分子参与、受多种调控机制调节的复杂过程。近年来,表观遗传调控在血管发育和生成中的作用越来越受到重视,已成为相关领域研究的热点之一。组蛋白修饰是表观遗传学研究的重要内容,发生在核小体组蛋白H2A、H2B、H3和H4的N端或C端。常见的组蛋白修饰包括甲基化修饰、乙酰化修饰、磷酸化修饰、泛素化修饰和SUMO修饰等,这些修饰对染色质的空间构象和基因转录有重要的调控作用。组蛋白的泛素化修饰主要发生在H2A和H2B上,H2A泛素化发生在C端的K119位点,泛素化H2A(ub H2A)占H2A总量的5~15%,是细胞核内泛素化程度最高的蛋白。而H2B泛素化发生在C端的K120位点,泛素化H2B(ub H2B)占H2B总量的1~2%。H2A的泛素化修饰与转录抑制相关,而泛素化的H2B则多在转录激活过程中发挥作用。除了对基因转录调控外,组蛋白泛素化修饰还在细胞周期及DNA损伤修复等过程中发挥着重要作用。组蛋白泛素化和去泛素化是一个可逆的过程,分别由组蛋白泛素化酶(泛素连接酶)和组蛋白去泛素化酶催化。MYSM1是一种去泛素化酶,其主要功能是去除细胞核中组蛋白H2A K119位点的泛素化修饰。MYSM1-/-小鼠在造血、免疫系统、皮肤、脂肪组织、视力、骨骼等多系统中存在异常,表明MYSM1功能重要,是不可替代的表观遗传学分子。有关MYSM1的研究目前主要集中于造血与免疫系统,但Huang YC等通过全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)发现MYSM1基因的2个单核苷酸的多态性位点(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)与台湾人群糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)发病相关。由于DR以微血管病变为主要病理特征,上述研究提示MYSM1可能在血管的发育和生成过程中扮演重要角色。为探明MYSM1在血管生成中的作用及其机制,本课题检测了MYSM1在血管内皮细胞中的表达,利用人脐静脉内皮细胞和MYSM1-/-小鼠在体内外验证了MYSM1在血管生成中的作用,构建了内皮细胞特异性敲除MYSM1的Cdh5-Cre~+-MYSM1~(f/f)小鼠并利用芯片初步筛选分析了MYSM1调控内皮细胞功能的信号通路和靶基因。上述研究结果明确了MYSM1对血管生成的促进作用,为深入探索其机制奠定了基础,为系统认识血管生成的调控提供了新线索。目的明确MYSM1在血管生成过程中的调控作用、初步探索其可能的机制。方法1.通过免疫组化染色、荧光染色、Western-blot以及q RT-PCR检测MYSM1在血管结构和人脐静脉内皮细胞中的表达情况以及在低氧和LPS刺激的情况下MYSM1的表达变化;2.体外HUVEC细胞转染小干扰RNA下调MYSM1的表达,通过流式细胞术、划痕实验、Transwell实验、血管形成实验和血管三维出芽实验分析MYSM1对人脐静脉内皮细胞多种生物学功能的影响;3.通过小鼠动脉环出芽实验以及小鼠视网膜血管的Lectin染色和脏器组织HE染色,检测MYSM1对血管形成以及功能结构完整性的作用;4.通过Cdh5-Cre小鼠和MYSM1~(f/f)小鼠交配获得内皮细胞特异性敲除MYSM1的Cdh5-Cre~+-MYSM1~(f/f)小鼠;5.利用基因芯片分析机制研究。结果1.免疫组化染色结果显MYSM1在血管组织中呈现较高表达,细胞荧光染色结果显示MYSM1主要是在HUVEC细胞核中表达,而在胞浆中几乎不表达;Western-blot和q RT-PCR实验显示HUVEC细胞中MYSM1的表达可以被小干扰si MYSM1下调;在低氧和LPS等促血管生成刺激下内皮细胞中MYSM1的表达升高;2.流式细胞术结果显示,下调HUVEC细胞中MYSM1的表达,细胞周期和细胞凋亡未见明显的变化;划痕实验和Transwell实验结果显示,下调HUVEC中MYSM1的表达,细胞的迁移和侵袭能力减弱;血管形成实验显示,下调HUVEC细胞MYSM1的表达,HUVEC细胞的血管形成能力降低;三维出芽实验结果显示,下调MYSM1的表达,HUVEC细胞的出芽能力降低;3.小鼠动脉环实验显示,C57/B16小鼠动脉环下调MYSM1的表达后出芽能力降低,MYSM1-/-小鼠的动脉环出芽能力也明显低于对照组小鼠;小鼠视网膜铺片实验结果显示,MYSM1-/-小鼠的视网膜血管的密度明显低于对照组小鼠。脏器组织HE染色发现MYSM1-/-小鼠血管周围炎性细胞聚集;4.已构建获得了内皮细胞特异性敲除MYSM1的Cdh5-Cre~+-MYSM1~(f/f)小鼠;5.芯片结果分析显示si RNA敲降MYSM1后,HUVEC细胞中血管生成相关信号通路变化明显,多种调控血管生成的细胞因子表达发生改变,其中抑血管生成因子Arresten和Canstatin上调明显,提示它们可能参与了MYSM1对血管生成的调控。结论1.MYSM1在血管内皮细胞中呈现高表达,且主要表达于细胞核;在低氧和LPS等促血管生成刺激时内皮细胞中的MYSM1表达升高;2.MYSM1对HUVEC细胞的细胞周期和细胞凋亡无影响,但能促进HUVEC细胞的迁移、侵袭、管腔形成和出芽能力;3.MYSM1能促进小鼠动脉环的出芽能力和视网膜血管的形成并对血管功能结构的完整性具有重要作用;4.构建获得了内皮细胞特异性敲除MYSM1的Cdh5-Cre~+-MYSM1~(f/f)小鼠;5.MYSM1可能通过对抑血管生成因子Arresten和Canstatin的调控影响血管生成。
【关键词】：血管生成 表观遗传调控 泛素化修饰 去泛素化酶
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R363
【目录】：

• 缩略语表4-7
• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-15
• 文献回顾15-24
• 第一部分 MYSM1在血管内皮细胞中的表达24-37
• 1 实验材料24-26
• 2 实验方法26-33
• 3 实验结果33-36
• 4 讨论36-37
• 第二部分 MYSM1对HUVEC细胞生物学功能的影响37-47
• 1 实验材料37-38
• 2 实验方法38-42
• 3 实验结果42-46
• 4 讨论46-47
• 第三部分 MYSM1对小鼠血管结构和功能的影响47-56
• 1 实验材料47-48
• 2 实验方法48-50
• 3 结果50-54
• 4 讨论54-56
• 第四部分 MYSM1促进血管生成的初步机制研究56-60
• 1 实验材料56
• 2 实验方法56
• 3 实验结果56-58
• 4 讨论58-60
• 小结60-62
• 参考文献62-70
• 个人简历和研究成果70-71
• 致谢71-72

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本文编号：453847