FADD磷酸化在其非凋亡功能中的作用研究

发布时间：2017-06-22 23:10

  本文关键词：FADD磷酸化在其非凋亡功能中的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：具有死亡功能区的Fas相关蛋白(Fas-associating protein with a novel death domain,FADD),最早是作为凋亡过程中的衔接蛋白被人们所熟知。随着研究的进一步深入,发现FADD也参与了多种非凋亡有关的细胞进程。南京大学华子春课题组围绕FADD的新生物学功能取得了多项研究进展。在此基础上,本文以构建6种过表达载体为起点,以果蝇作为模式动物,采用标准的显微注射技术,构建转基因果蝇模型,并进一步研究磷酸化FADD的非凋亡功能。首先,构建老鼠全长的FADD (mFADD)、持续磷酸化mFADD (S191D)、持续非磷酸化mFADD(S191A)、C末端敲除的mFADD、BG4、及选择标记c-myc(对照)6种过表达载体,我们根据鼠FADD基因序列并利用重叠延伸PCR定点突变方法,获得磷酸化mFADD、非磷酸化mFADD、C末端敲除的mFADD及序列正确的BG4。将各形式的FADD片段通过PCR扩增后,连接到载体pUASTattB中。其次,采取标准的显微注射技术,注射24872(2号染色体定点突变)果蝇胚胎,以橘黄眼或红眼为转基因的标记表现型,获得过表达mFADD、C末端敲除、pFADD、npFADD、BG4、c-myc的转基因果蝇。第三,制备dFADD基因敲除果蝇,利用CRISPR/Cas9技术,采取标准的显微注射技术,注射到果蝇54591(持续表达Cas9的转基因果蝇)胚胎中,待幼虫羽化后逐个逐代进行杂交鉴定。第四,分析上述六种过表达转基因果蝇的遗传性状：(1)转基因果蝇遗传表型分析：对眼睛及翅膀表型分析,结果显示部分FADD-D果蝇翅膀出现卷曲现象,但对果蝇眼睛并没有明显的影响。(2)对细胞周期的影响：检测细胞周期相关蛋白cyclinE mRNA的表达情况,观察是否发生表达紊乱；(3)天然免疫中的作用分析：检测参与Imd途径的Dredd蛋白mRNA的表达水平；(4)糖代谢相关酶的表达变化：检测果蝇中糖代谢相关酶G6pc、Pepck mRNA的表达变化；(5)攀爬、寿命分析：统计结果表明,FADD-D果蝇攀爬能力下降、寿命变短,并且各转基因果蝇攀爬能力及寿命较对照组都有明显下降趋势；最后,获得在dFADD knock down(RNAi)的基础上,过表达FADD的转基因果蝇：分别将dFADD knock down的果蝇、各种过表达的转基因果蝇与含双平衡子工具果蝇杂交。根据平衡子的表型特征,挑选子一代果蝇,将子一代杂交得到子二代果蝇,从而获得我们预期的转基因果蝇。综合以上研究结果,我们认为FADD磷酸化对果蝇的寿命及运动能力产生影响。
【关键词】：黑腹果蝇 转基因果蝇 FADD磷酸化 非凋亡功能
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R3416
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 主要缩略词表10-11
• 绪言11-13
• 第一部分 文献综述13-25
• 一、FADD及其凋亡功能13-14
• 二、FADD磷酸化的非凋亡功能研究进展14-24
• 小结24-25
• 第二部分 实验材料与方法25-45
• 一、实验材料25-30
• 二、实验方法30-45
• 第三部分 实验结果与讨论45-65
• 第一章 FADD过表达转基因模型的建立45-53
• 前言45-47
• 结果47-52
• 讨论52-53
• 第二章 CRISPR/Cas9基因敲除FADD果蝇模型的建立53-58
• 前言53-54
• 结果54-58
• 第三章 FADD过表达果蝇模型遗传性状的初步分析58-65
• 前言58
• 结果58-63
• 讨论63-65
• 结论65-66
• 参考文献66-71
• 致谢71-72
• 作者简介72

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本文编号：473375