呼吸道合胞病毒种系进化特征的研究

发布时间：2017-06-27 23:12

  本文关键词：呼吸道合胞病毒种系进化特征的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)是引起婴幼儿下呼吸道感染的主要病原,也是免疫缺陷患者和老年人群重要的呼吸道感染病原。据统计,2013年RSV在全球导致23,000-65,000起5岁以下儿童死亡病例。依据抗原性和遗传性的差异,可将RSV分为RSVA和RSVB两个亚组。通过G蛋白胞外段第二高可变区基因序列(The Second Highly Variable Region, HVR2)的差异性又将每个组进一步分成多个基因型。虽然RSV仅有一个血清型,但自1955年首次发现至今,已发现了36个基因型。在新出现的基因型的突变中,除了基因的点突变,还出现了HRV2区域较大核苷酸片段插入突变,产生了B亚组BA型和A亚组的ON1型。对RSV变异进化特点的研究表明,RSV G蛋白在病毒的进化中存在氨基酸热点突变,而G蛋白具有调控宿主免疫反应的重要功能蛋白,提示这些突变位点在RSV持续流行具有重要意义。但是现有报道均是基于部分年限的研究,且多基于HRV2基因区域。而自2005年后又发现有16个新基因型的流行,新基因型逐渐替代旧基因型。那么我国的RSV分子流行特点是什么,是否与全球其他国家报道的RSV流行具有相似的趋势?基因型相关的基因突变与RSV进化中相关氨基酸突变在病毒进化中的动力作用如何?作为进化动力研究的G基因,其第一高可变区(The First Highly Variable Region, HVR1)是否在进化中存在协同的氨基酸突变效应等尚不清楚。本研究将对2005年-2015年我国流行的RSV分子流行特征和近36年全球流行的RSV开展种系进化研究,为完善和阐明RSV的进化变异特征提供数据参考。本研究通过对2005年至2015年间收集的我国北京地区、山东省、甘肃省和云南省的1601份RSV核酸检测阳性的急性呼吸道感染病例样本进行G基因扩增,获得G全长基因序列共514条,包括RSVA 289条,RSVB225条。获得HVR2基因共1238条,包括RSVA691条,RSVB 547条。通过构建基于HVR2基因的最大似然法进化树,参考已发表序列进行基因分型,将RSVA和B共分成14个基因型,RSVA包括NA1、NA2、NA3、NA4、GA5和ON1共6个基因型,RSVB包括BA4、BA7、BA9、BA10、BAC、GB3、CB1和SAB4共8个基因型。根据病例样本的采集时间,绘制RSV及其基因型的时间分布图,发现RSVA和RSVB可在同年共检出,但以一种亚组为主,呈交替流行的特点。RSVA_NA1基因型在2007年至2012年A亚组流行季节呈优势流行,自2013年ON1首次检出,并在随后的两个流行季检出率逐年升高,替换NA1成为A亚组优势流行基因型。RSVB_BA9基因型在研究期间呈优势流行。2011年前我国流行的A和B亚组基因型已经全部被替换。ON1基因型阳性病例具有更高的肺炎诊断比率。BA10基因型阳性病例中先天性心脏病病史诊断比率高于其他基因型。各亚组基因型的感染无性别差异(P=-0.2059)。为了深入分析RSV种系进化特征,本研究分别基于全长G基因和HVR2基因,分析了全球近36年的RSV的种系进化特征。通过贝叶斯-蒙特卡洛方法分析发现,B亚组较A亚组具有更快的碱基替换速率,其G基因和HRV2的平均替换速率分别为2.83×10-3,1.82×10-3；4.34×10-3,3.41×10-3碱基位点/年。B亚组具有阳性选择位点的基因型及阳性位点更多。对RSV分子流行特点的研究发现A亚组中呈现了更多频次的基因型的替换流行情况,B亚组则以BA9和BA10的持续流行为主。因此上述发现的B亚组不同于A亚组的进化特点可能与不同亚组基因型替换的频次、优势流行基因型及基因型持续流行时间有关,提示A和B亚组在选择压力下具有不同的分子进化特点。基于G基因和HRV2基因对A亚组基因型的分析4个(225V、250P、274P和314P)和10个(215P、26L、233K、247L、256P、258H、262E、274L、280Y和314P)阳性选择位点(P95%,参考株为AB754590)。其中有三个基因型出现了阳性选择,分别为GA5的第126L、262E和321Q、ON1的第273Y位和NA1的237D和274P,未发现这些阳性选择位点具有回复突变特点。对B亚组所有基因型的G和HRV2基因分析分别发现了5个(4H、219L、223P、252V和288V)和3个(221P、236K和249V)阳性选择位点(P95%,参考株JX198152)。其中基于每种基因型的分析发现5个基因型存在阳性选择位点,分别为BA3第216P,BA1I第267F和285Y位,GB1第152P；BA9第4N、219L、268I、275I、276A、285Y和292Y,GB3第249V以及GB4第256G和312I为阳性选择位点。上述研究中发现HRV1区域虽然也存在阳性选择位点,但远少于HRV2区,提示G基因强阳性选择区域为HRV2区。基于所有基因型的分析与分别对每种基因型的分析获得的阳性选择位点不同,表明基因型相关突变与特点基因型内部氨基酸阳性选择突变在不同亚组进化中的动力作用,B亚组的抗原表位相关的氨基酸阳性选择位点多于A亚组,这与A亚组主要流行基因型单一且基因型多样性较B亚组少有关。对阳性选择位点的时序演化分析发现第221和268位具有回复突变特点。上述发现的阳性选择位点均位于抗原表位区,提示其病毒进化中可能具有重要免疫调控功能,有待进一步的实验验证。但基于G基因和HRV2基因计算获得的存在阳性选择的基因型及其阳性选择位点不完全一致,可能与参与计算的基因序列有关。基于模型计算推测RSVA和B的起源时间分别在1950s和1960s年。综上,本研究发现在我国A亚组中的6种基因型和B亚组中8种基因型的共流行。发现RSVA和RSVB交替流行、多种基因型的共流行和基因型的替换流行是RSV主要的分子流行特点。虽然不同国家同时期流行的基因型种类虽然略有差异,但均呈现A NA1和B BA基因型高流行,以及近两年NA1被ON1替换特点。表明RSV在全球存在不依赖于地域的主要流行基因型及其替换模式的分子流行特点。发现RSVB具有更快的碱基替换速率,且A亚组中的阳性选择位点未见回复突变演化特征；B亚组阳性选择位点部分具有回复突变特点,上述位点均位于抗原表位区。发现基因型相关氨基酸突变与抗原表位相关氨基酸阳性选择突变在亚组内部进化中的动力作用特点。本研究结果完善了对RSV分子流行特征的认识,对基因型流行进化中氨基酸热点突变特征的阐释及其潜在的功能分析,为阐明RSV的在宿主免疫压力下的逃逸机制提供了线索。
【关键词】：呼吸道合胞病毒 基因型 种系进化 阳性选择 G蛋白
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373.14
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 缩略词表11-12
• 引言12-21
• 第一章 RSV分子流行特点的研究21-39
• 1. 材料与方法21-24
• 2. 结果24-36
• 3. 讨论36-38
• 4. 小结38-39
• 第二章 RSV种系进化特征的研究39-54
• 1. 材料与方法39-41
• 2. 结果41-52
• 3. 讨论52-53
• 4. 小结53-54
• 附录54-83
• 参考文献83-92
• 在学期间发表的学术论文92-93
• 致谢93

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本文编号：491605