HIV-1融合蛋白gp41自然突变及功能研究

发布时间：2017-06-29 05:15

  本文关键词：HIV-1融合蛋白gp41自然突变及功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：HIV包膜蛋白(Env)在病毒入侵过程中起着关键的作用：介导受体结合和膜融合。研究表明,6-HB的形成是HIV膜融合的关键所在,而来自于NHR和CHR的多肽可以阻断病毒6-HB的形成,是理想的药物靶点。基于我们在gp41上发现的新结构M-T钩子,我们以模板SC22EK设计了短小多肽MT-SC22,其具有极高的抑制活性,并且有很高的耐药基因屏障。前期我们用模板短肽SC22EK及具有高抑制活性的MT-SC22筛选出在gp41保守序列上发生剧烈的氨基酸突变的两个氨基酸位点(Glu49、Leu57),分别简称为E49K、L57R。本研究对HIV database Env序列进行了分析,发现在E49位点上出现由E突变为A、D、G、K、N、Q、S共七种自然突变；在L57位点上共出现由L突变为F、P、R、V四种自然突变。为了更全面地研究L57氨基酸位点的功能,本研究另外加入了L57A突变,一共12组氨基酸突变。本课题以表达HIV-1毒株NL4-3囊膜蛋白(Env)的质粒作为模板进行定点突变,成功获得了12个系列突变质粒。经Western Blot和capture ELISA检测证实这些突变不影响Env的表达和切割；紧接着我们分析了突变对病毒入侵靶细胞能力以及膜融合抑制剂抗病毒活性的影响,发现多个自然突变能够显著影响HIV-1的入侵能力,并介导对抑制剂的高度耐药；同时以NHR多肽N36为模板合成含有以上12种氨基酸突变的系列多肽,比较分析了N36、N36E49-x、 N36L57-X对NL4-3假病毒株的抑制活性以及多肽自身螺旋稳定性,结果显示突变后的氨基酸对NHR螺旋稳定性、NHR螺旋三聚体与CHR亲和性都有一定影响。我们从突变点对病毒囊膜蛋白功能、NHR稳定性、6-HB稳定性和抑制剂亲和力四个主要方面,深入探讨了HIV-1膜融合抑制剂的耐药机制。综合多方面的研究结果,本研究得出以下结论：(1)E49和L57的突变毒株对短肽抑制剂(如SC22、HP23等)有较强的拮抗作用,而对长肽类抑制剂(如T20、SFT)的作用效果不明显；(2)病毒突变的氨基酸与CHR或抑制剂上相应的氨基酸之间的电荷相互作用可以影响抑制剂的效率；另一方面,突变点可以影响病毒与抑制剂整体结合力；病毒突变后最终表现出的耐药现象是此两种因素共同影响下的一个平衡的结果；(3)病毒的入侵能力与耐药性的高低基本符合“入侵能力越差耐药倍数就越高”这一理论；(4) E49S/N/G三种突变对NHR螺旋稳定性的影响是病毒耐药性的主要影响因素；(5) E49A/Q/D三种突变后的氨基酸电荷对螺旋束整体稳定性的影响作用主导了病毒的耐药表现；(6)脯氨酸(P)属于亚氨基酸,是α螺旋的破坏者,突变又处于NHR的核心区域,病毒发生L57P突变后完全丧失感染能力；(7)L57A/F/V三种突变,由于仍然保持了L57位点的疏水性,所以对短肽的活性影响比较温和；(8)由于芳香族氨基酸F带有的苯环形成空间位阻,减弱了NHR与抑制剂的亲和力,所以L57F对C34和SFT呈现弱耐药。本研究对HIV-1融合蛋白gp41的结构与功能、gp41介导的病毒膜融合机制、以及抑制剂的耐药机制具有重要的科学意义,为研发膜融合抑制剂类艾滋病药物提供了新的思路。
【关键词】：HIV-1 gp41 病毒进入 膜融合抑制剂 突变 耐药机制
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 前言11-15
• 1. 实验材料15-21
• 1.1. 相关感受态和细胞15
• 1.2. 实验相关工具酶和抗体15
• 1.3. 引物15-16
• 1.4. 所用溶液和培养基16-18
• 1.5. 相关试剂盒18
• 1.6. 实验相关多肽18-19
• 1.7. 主要仪器19-21
• 2. 实验方法21-27
• 2.1. 针对HIV-1 Env gp41蛋白上E49、L57两位点氨基酸突变频率的统计21
• 2.2. 以标准实验株HIVNL4-3的Env质粒为模板进行氨基酸定点突变21-22
• 2.3. Western Blot检测Env的表达情况22-23
• 2.4. Capture ELISA检测Env的表达情况23-24
• 2.5. 假病毒的包装制备24
• 2.6. 功能性假病毒的滴度测定24-25
• 2.7. 假病毒的p24抗原定量25
• 2.8. HIV-1突变假病毒定量单次入侵实验25
• 2.9. 多肽对HIV-1假病毒的抑制率的检测25-26
• 2.10. 用圆二色谱仪检测突变对N肽α螺旋形成和螺旋稳定性的影响26-27
• 3. 实验结果27-39
• 3.1. E49和L57两位点氨基酸突变频率的统计结果27-30
• 3.2. 点突变后HIV-1 Env的表达情况30
• 3.3. 突变位点对假毒株入侵靶细胞能力的影响30-32
• 3.4. 短肽类抑制剂对突变假毒株的抑制情况32-34
• 3.5. 突变假毒株对第一代和新一代膜融合抑制剂的耐药性检测34-36
• 3.6. 点突变后对N肽类抑制剂抗病毒活性的影响36-37
• 3.7. CD检测突变点对NHR螺旋稳定性的影响37-39
• 4. 讨论39-45
• 5. 小结45-47
• 参考文献47-53
• 综述53-65
• 二、前言53-54
• 三、针对HIV-1 gp41的膜融合抑制剂的抗病毒机制54-55
• 四、N肽类膜融合抑制剂55-56
• 1. 源于NHR序列的N肽类膜融合抑制剂55
• 2. 重组嵌合体N肽类膜融合抑制剂55-56
• 五、C肽类膜融合抑制剂56-60
• 1. 源于CHR序列的C肽类膜融合抑制剂56-57
• 2. 改造的C肽类膜融合抑制剂57-60
• 六、总结60
• 参考文献60-65
• 附录65-71
• 致谢71-73
• 个人简历73

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