两种乳酸杆菌的S-层蛋白对HT-29细胞的免疫调节功能研究

发布时间：2017-07-03 13:24

  本文关键词：两种乳酸杆菌的S-层蛋白对HT-29细胞的免疫调节功能研究

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【摘要】：S-层蛋白是位于一些细菌细胞壁外层的一种蛋白成分。乳酸杆菌的S-层蛋白对其发挥益生功能具有重要作用。许多研究证实乳酸菌定殖于宿主肠道中,能够对宿主的免疫系统发挥重要的调节作用。而S-层蛋白作为其最外层成分,其参与乳酸杆菌拮抗病原菌黏附及入侵宿主细胞、保护乳酸杆菌在胃肠道中维持正常的生物活性等方面具有重要作用。但是,目前关于S-层蛋白对宿主细胞免疫调节作用的研究较少,所以本课题以宋内志贺菌作为炎性刺激物,研究从Lactobacillus paracasei subsp.paracasei M5-L和Lactobacillus casei Q8-L两种乳酸杆菌上分离的S-层蛋白对HT-29细胞的免疫调节作用。采取5 mol/L的LiCl提取S-层蛋白,并利用1 mol/L的LiCl通过盐析的方法来纯化粗提蛋白,SDS-PAGE检测表明两株菌均在45 kDa处有单一条带。调整S-层蛋白浓度作用细胞,经MTT实验最终确定其作用浓度为100μg/mL,Shigella sonnei与细胞的感染复数为20:1,作用时间为6 h进行后续实验。MTT实验证实了两种S-层蛋白能够抑制S.sonnei对HT-29细胞增殖的影响,在作用时间为6 h时,预防组及治疗组具有明显的效果;在作用时间为12 h时,则为竞争组的效果较好。通过对倒置显微镜下细胞形态的观察、台盼蓝染色实验的验证,再次证实了S-层蛋白能够拮抗S.sonnei对细胞活性的有害影响。通过对细胞上清液中NO含量的检测,证明两种S-层蛋白能够降低S.sonnei引起的细胞过度分泌NO,并且这种抑制作用与浓度有关。通过ELISA测定细胞分泌的IL-8、IL-10、TNF-α、IL-1β的水平及RT-PCR对相应细胞因子的mRNA表达情况的研究,证实了两种S-层蛋白能够在基因及蛋白水平诱导细胞产生抗炎性细胞因子IL-10,同时能够在基因及蛋白水平拮抗S.sonnei刺激细胞分泌的促炎性细胞因子IL-8、TNF-α、IL-1β。进一步通过Western Blot法对HT-29细胞的MAPK信号通路进行研究,发现两种S-层蛋白能够通过降低p-JNK蛋白的表达水平,进而拮抗S.sonnei对JNK信号通路的活化作用。实验证实了S-层蛋白能够通过对细胞因子及信号通路的调节,进而对宿主细胞的免疫作用进行调控。流式细胞术检测HT-29细胞周期及细胞凋亡情况,证实两种S-层蛋白均能够调节S.sonnei导致的细胞周期紊乱的状态,并对S.sonnei诱导的凋亡细胞大量增加的情况进行抑制,进一步证实了S-层蛋白能通过对S.sonnei的抑制作用进而保护宿主细胞。研究也表明S-层蛋白能够通过拮抗细胞Caspase-1的活性,进而抑制S.sonnei引起的细胞炎性,通过对Caspase-3活性的降低,进而减少S.sonnei引起的细胞凋亡。
【关键词】：S-层蛋白 细胞增殖 免疫调节 细胞凋亡
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R37
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 绪论11-18
• 1.1 课题来源及研究的背景意义11-12
• 1.2 乳酸杆菌S-层蛋白的结构12-13
• 1.3 乳酸杆菌S-层蛋白的功能13-14
• 1.3.1 S-层蛋白对胆盐及消化酶的耐受能力13
• 1.3.2 S-层蛋白参与乳酸杆菌对宿主的黏附作用13-14
• 1.3.3 S-层蛋白抑制病原菌对宿主细胞的黏附及侵入作用14
• 1.4 乳酸杆菌S-层蛋白的免疫调控作用14-16
• 1.5 国内外文献综述的简析16
• 1.6 本课题主要研究内容16-17
• 1.7 技术路线17-18
• 第2章 材料和方法18-31
• 2.1 材料及仪器18-22
• 2.1.1 材料与试剂18-20
• 2.1.2 实验仪器20-22
• 2.1.3 培养基22
• 2.1.4 菌种及细胞来源22
• 2.2 乳酸杆菌及S.sonnei的培养22-23
• 2.3 乳酸杆菌S-层蛋白的提取、纯化及鉴定23-24
• 2.3.1 乳酸杆菌S-层蛋白的提取23
• 2.3.2 乳酸杆菌S-层蛋白的纯化23
• 2.3.3 SDS-PAGE电泳测定S-层蛋白分子量23-24
• 2.3.4 BCA法测定S-层蛋白浓度24
• 2.4 乳酸杆菌的S-层蛋白对HT-29细胞的干预处理24-25
• 2.5 MTT法检测HT-29细胞的活性25
• 2.6 台盼蓝染色实验25-26
• 2.7 NO试剂盒测HT-29细胞上清液中NO的含量变化26
• 2.8 ELISA法测HT-29细胞上清液中细胞因子IL-8、IL-10、TNF-α、IL-1β的含量变化26
• 2.9 RT-PCR法测定HT-29细胞中IL-8、IL-10、TNF-α、IL-1β的mRNA表达情况26-28
• 2.10 流式细胞术测定细胞周期28
• 2.11 不同处理对HT-29细胞Caspase-1 和Caspase-3 活性的影响28-29
• 2.12 流式细胞术测定细胞凋亡29
• 2.13 Western Blot测定HT-29细胞内MAPK信号途径中ERK、p-ERK、p38、p-p38、JNK和p-JNK蛋白表达量的变化29-30
• 2.14 数据处理及绘图30-31
• 第3章 乳酸杆菌的S-层蛋白抑制S.sonnei对细胞增殖作用及形态影响的研究31-42
• 3.1 乳酸杆菌S-层蛋白的分离纯化31-33
• 3.1.1 乳酸杆菌S-层蛋白的SDS-PAGE31-32
• 3.1.2 BCA法测定乳酸杆菌S-层蛋白的含量32-33
• 3.2 MTT检测不同处理下HT-29细胞活性33-37
• 3.2.1 不同浓度的S-层蛋白对HT-29细胞活性的影响33-35
• 3.2.2 不同S.sonnei的感染复数对HT-29细胞活性的影响35-37
• 3.3 不同处理下的HT-29细胞学研究37-39
• 3.4 台盼蓝染色实验39-40
• 3.5 本章小结40-42
• 第4章 乳酸杆菌的S-层蛋白对细胞因子调节作用及对MAPK信号通路的研究42-63
• 4.1 两种S-层蛋白对S.sonnei诱导NO产生的抑制作用42-44
• 4.2 ELISA法测HT-29细胞上清液中IL-8、IL-10、TNF-α、IL-1β的含量变化44-50
• 4.2.1 HT-29细胞上清液中IL-10的含量44-46
• 4.2.2 HT-29细胞上清液中IL-8 的含量46-47
• 4.2.3 HT-29细胞上清液中IL-1β的含量47-49
• 4.2.4 HT-29细胞上清液中TNF-α的含量49-50
• 4.3 RT-PCR法测定HT-29细胞中IL-8、IL-10、TNF-α、IL-1β的mRNA表达情况50-58
• 4.3.1 HT-29细胞中IL-10的基因的表达水平50-51
• 4.3.2 HT-29细胞中IL-8 的基因的表达水平51-53
• 4.3.3 HT-29细胞中IL-1β的基因的表达水平53-55
• 4.3.4 HT-29细胞中TNF-α的基因的表达水平55-58
• 4.4 不同处理时对HT-29细胞MAPK信号通路的研究58-61
• 4.4.1 M5-L的S-层蛋白对HT-29细胞MAPK通路的影响58
• 4.4.2 Q8-L的S-层蛋白对HT-29细胞MAPK通路的影响58-61
• 4.5 本章小结61-63
• 第5章 乳酸杆菌的S-层蛋白拮抗S.sonnei对细胞凋亡的研究63-73
• 5.1 两种S-层蛋白的不同处理对HT-29细胞周期的影响63-65
• 5.2 两种S-层蛋白对HT-29细胞Caspase-1 和Caspase-3 活性影响65-68
• 5.2.1 不同处理对HT-29细胞Caspase-1 活性的研究65-66
• 5.2.2 不同处理对HT-29细胞Caspase-3 活性的研究66-68
• 5.3 两种S-层蛋白的不同处理对HT-29细胞凋亡的影响68-71
• 5.4 本章小结71-73
• 结论73-74
• 参考文献74-83
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文83-85
• 致谢85

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