S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（SAHN）对大肠杆菌群感效应的调控研究

发布时间：2017-07-05 01:05

  本文关键词：S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（SAHN）对大肠杆菌群感效应的调控研究

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【摘要】：在感染病领域,耐药细菌的感染是目前全球关注的重要问题之一。现阶段采取的相应策略主要有:(1)通过合理使用抗生素以降低细菌耐药的变异速度;(2)探讨新的抑菌生化途径,研发新型的抗菌药物,使之用于对抗耐药菌。以甲基化修饰为途径,进而使抗菌药物靶点的结构发生改变,这是常见致病菌的一种重要耐药机制。S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)作为一种重要的酶参与甲基循环,对S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖的甲基转移反应产生的通用产物S-腺苷高半胱氨酸(SAH)进行裂解,并促使甲硫氨酸(Met)和腺嘌呤(Adenine)进行再生,进而产生通用群感效应信号分子AI-2。群感效应所产生的生物膜作为细菌生长分裂的一种重要的保护模式,能保证细菌在恶劣环境下可以生存,也会使细菌对抗抗生素的能力提高,生物膜的形成成为细菌耐药的重要机制之一,这也是大多数慢性传染性疾病难以控制的主要原因。首先,SAHN酶活性下降会造成菌体内S-腺苷高半胱氨酸的累积,作为SAM所依赖的甲基转移酶的有效反馈抑制剂,菌体内SAH的积累就会使甲基转移反应受到全面抑制,进而以影响基因表达调控和蛋白修饰的方式来降低病原菌的适应性,使细菌的生长和分裂得到抑制。其次,抑制SAHN酶蛋白会使群感效应信号分子的前体缺失,使病原菌无法顺利合成信号分子,可使细菌群感效应,如:病原菌毒力因子的表达、菌膜的形成等得到有效控制。综上,SAHN酶蛋白活性变化会对大肠杆菌生长分裂以及群感效应产生影响。由于哺乳动物细胞中并不存在这种核苷酶,因此,SAHN酶在致病菌中的功能分析和研究成为发展新型广谱杀菌剂的一种新思路。本论文以大肠杆菌的全基因组DNA做为模板,利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)的方法扩增目sahn基因,构建重组表达载体。以IPTG为诱导剂进行诱导表达,并通过Ni-NTA亲和层析对SAHN酶蛋白进行纯化。将纯化后的蛋白经除盐浓缩后用考马斯亮蓝法测其蛋白含量约为348μg/m L。并进一步建立了黄嘌呤氧化酶的酶偶联分析检测技术对SAHN酶蛋白进行了酶活性测定。通过设计梯度下pH及温度反应体系对SAHN酶蛋白酶促反应最佳pH及温度进行分析,实验表明SAHN在广泛的pH条件下均具有酶活性,并发现该蛋白热稳定性较差。最后通过比较SAHN酶蛋白在不同表达水平下,对其群感效应的表征信号分子AI-2合成量也是不同。在大肠杆菌生物膜实验中,发现SAHN酶蛋白在过量表达水平下,使大肠杆菌生物膜的生成量及致密性上升。在实验结果中可以发现,SAHN酶蛋白在过量表达下,会加强菌体的群感效应,从而为发展以SAHN为药物靶点的新型抗感染药物提供理论和实验上的依据和参考。
【关键词】：S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN) 生物膜 群感效应 信号分子AI-2
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.21
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 第一章 绪论12-20
• 1.1 大肠杆菌的致病机理12-13
• 1.2 抗细菌感染药物的研究13-14
• 1.3 SAHN酶蛋白参与甲基循环14-15
• 1.4 细菌的群感效应15-16
• 1.5 自诱导剂-2（AI-2）16-18
• 1.5.1 AI-2 的生物合成途径16-17
• 1.5.2 AI-2 的生物学功能17-18
• 1.6 展望18-20
• 第二章 实验材料、仪器与方法20-39
• 2.1 实验材料20-22
• 2.2 实验仪器22-23
• 2.3 实验方法23-39
• 2.3.1 重组E.coli S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)的克隆23-30
• 2.3.1.1 目的基因的选择23
• 2.3.1.2 PCR引物的设计23
• 2.3.1.3 大肠杆菌总DNA的提取23-24
• 2.3.1.4 PCR扩增sahn基因24
• 2.3.1.5 PCR扩增产物的纯化24-25
• 2.3.1.6 建立连接反应体系25
• 2.3.1.7 感受态细胞的制备25
• 2.3.1.8 重组克隆载体转化25-26
• 2.3.1.9 鉴定阳性克隆载体26
• 2.3.1.10 提取构建及保藏质粒26-27
• 2.3.1.11 对pMD18-T-SAHN、pET-28a质粒进行双酶切27
• 2.3.1.12 胶回收酶切片段27-28
• 2.3.1.13 构建表达载体28
• 2.3.1.14 感受态细胞的制备28
• 2.3.1.15 表达载体转化28-29
• 2.3.1.16 阳性重组子的鉴定29-30
• 2.3.2 SAHN蛋白的表达30-31
• 2.3.2.1 IPTG诱导表达30
• 2.3.2.2 大肠杆菌细胞破碎30-31
• 2.3.3 SAHN蛋白的纯化31-34
• 2.3.3.1 SAHN蛋白的亲和层析31-32
• 2.3.3.2 SAHN蛋白浓缩除盐32
• 2.3.3.3 纯化浓缩的结果验证32-34
• 2.3.4 测定SAHN蛋白浓度34
• 2.3.5 SAHN酶活测定及酶促反应最适条件分析34-37
• 2.3.5.1 酶偶联分析检测技术34-35
• 2.3.5.2 建立酶偶联反应体系35
• 2.3.5.3 温度对酶促反应的影响35-36
• 2.3.5.4 pH对酶促反应的影响36-37
• 2.3.6 信号分子AI-2 的制备与检测37
• 2.3.6.1 信号分子AI-2 的制备37
• 2.3.6.2 信号分子AI-2 的检测37
• 2.3.7 生物膜实验37-39
• 第三章 实验结果与分析39-50
• 3.1 重组大肠杆菌S-腺苷高半胱氨酸核苷酶的克隆39-41
• 3.1.1 目的基因sahn的PCR扩增39
• 3.1.2 重组表达载体的抗性筛选39-40
• 3.1.3 阳性表达载体的鉴定40
• 3.1.4 测序结果及分析40-41
• 3.2 重组大肠杆菌S-腺苷高半胱氨酸核苷酶的表达41-45
• 3.2.1 SAHN蛋白的表达结果41
• 3.2.2 目的蛋白浓度的测定及分析41-42
• 3.2.3 目的蛋白的酶偶联分析检测方法的分析42
• 3.2.4 SAHN酶反应动力学分析42-43
• 3.2.5 温度对酶促反应影响的分析43-44
• 3.2.6 pH对酶促反应影响的分析44-45
• 3.3 重组大肠杆菌S-腺苷高半胱氨酸核苷酶的群感效应分析45-50
• 3.3.1 SAHN酶蛋白在不同表达水平下信号分子AI-2 的检测45-46
• 3.3.2 SAHN酶蛋白在不同表达水平下生物膜的检测46-50
• 第四章 结论与展望50-52
• 参考文献52-58
• 致谢逡逑58-59
• 附录59

【参考文献】

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1 陈海珍;杨华;胡忠义;杨焕森;马慧;高诗会;郭琪;柏文娟;秦莲花;李连青;;结核分枝杆菌甲硫腺苷核苷酶的原核表达及活性分析[J];中华微生物学和免疫学杂志;2012年07期

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本文编号：519942