锦南复方改善2型糖尿病模型大鼠胰岛素抵抗及机制初探

发布时间：2017-07-05 19:12

  本文关键词：锦南复方改善2型糖尿病模型大鼠胰岛素抵抗及机制初探

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【摘要】：目的2型糖尿病是由于胰岛素分泌相对不足或胰岛素作用障碍所致的以血糖升高为主要特征的一种代谢性疾病,其中胰岛素抵抗(Insulin resistance, IR)是2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM)的典型特征,也是T2DM的发病基础。2型糖尿病是危害人类健康的严重的代谢性疾病,且发病率逐年攀升,2型糖尿病及其并发症所导致的死亡率呈上升趋势。现有治疗2型糖尿病的主要措施包括饮食控制、运动,在控制效果不佳的情况下选择口服降糖药物,必要时可用胰岛素。大部分2型糖尿病患者服用口服降糖药,如双胍类、磺酰脲类、噻唑烷二酮类药物。但是长期服用可导致如白细胞减少、溶血性贫血、损伤消化道等不良反应。近年来,中药以其服用方便、安全低毒、调节血糖作用温和等特点凸显优势。锦南复方(Jin Nan Compound, JNC)为苏州太仓当地的民间验方,对防治糖尿病、高血压等具有重要意义。本论文旨在通过体内、外实验验证锦南复方降低血糖、改善2型糖尿病胰岛素抵抗的作用,并进一步研究JNC对胰岛素受体物-1丝氨酸磷酸化(phosphorylation-Insulin Receptor Substrate 1 Serine 307, p-IRS-1 Ser307)、磷酸酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-Kinase, PI3K)、葡萄糖转运体4 (Glucose Transporter 4, GLUT-4)蛋白表达的影响,初步探明JNC改善IR的作用机制。方法第一部分：HepG2细胞置于含10%小牛血清的DMEM培养基中,于37℃、5%CO2孵箱中培养。取传代培养的HepG2细胞,将细胞以103个/孔接种于96孔板,37℃,5%CO2孵箱培养24 h。弃去培养基,PBS清洗1次,加入含有10μg/ml胰岛素的培养基200μL, HepG2细胞于37℃,5%CO2条件培养24 h,建立IR细胞模型。取IR模型细胞分别设为对照组、模型组、JNC高、中、低剂量组。JNC组分别加入120,60,30μg/ml JNC。每组设6个复孔,加入受试药物24 h后通过葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD)测定培养液的葡萄糖浓度,计算葡萄糖吸收率。采用MTT法检测JNC对HepG2细胞增殖的抑制率。运用Western-Blot法检测p-IRS-1 Ser307、PI3K、GLUT-4表达,分析JNC干预对IR模型细胞相关蛋白的影响。第二部分：雄性SD大鼠适应性饲养一周。按50mg/kg腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)建立化学性损伤糖尿病大鼠模型,选择空腹血糖值高于11.1mmol/1的成模大鼠随机分为模型组、阳性对照组(参芪颗粒300mg/kg)、锦南复方高、中、低(300,150,75mg/kg)3个剂量组,每组10只。分别灌胃给予受试药与阳性对照药,对照组、模型组灌胃等容量生理盐水。实验第3周,大鼠禁食12 h,进行口服糖耐量实验(OGTT)。末次给药后禁食12 h,不禁水,眼内眦取血,分离血清4℃冰箱保存待测；分离并称量：心、肝、脾、肺、肾脏组织,计算脏器系数。第三部分：雄性SD大鼠,正常组(10只)给予基础饲料,其余50只大鼠喂养高脂饲料4周后,按45 mg/kg体重腹腔注射STZ建立2型糖尿病大鼠IR模型。将成模大鼠随机分为模型组.JNC 160 mg/kg组、NC 80 mg/kg组、JNC 40 mg/kg组,阳性对照二甲双胍200mg/kg组。各组继续给予高脂饲料喂养,并灌胃给予相应的受试药物,对照组给予基础饲料。对照组与模型组灌胃给予等容积生理盐水,每天上午给药1次,连续干预4周,每周称重1次,随体重增减及时调整给药量。至实验第3周,禁食12小时,进行口服糖耐量实验。末次给药后禁食12小时,眼内眦取血,分离血清,检测血糖、血脂、胰岛素水平；取部分肝脏制备肝匀浆,离心分离上清,测定肝糖原水平；分离肝、胰腺组织制作切片,进行组织形态学检查,观察有无病理改变。使用免疫组化法测肝脏中GLUT-4、p-IRS-1 Ser307表达水平。结果第一部分：HepG2细胞置于含10μtg/ml胰岛素培养液孵育24 h,与对照组比较,葡萄糖吸收率下降,表明建模成功。模型细胞经不同浓度的JNC干预,与模型组比较,葡萄糖吸收率显著增加。模型细胞GLUT-4、PI3K蛋白表达显著高于IR细胞,而p-IRS-1 Ser307水平则明显受到抑制。给予不同剂量JNC干预后,GLUT、PI3K蛋白表达显著上调,IRS-1Ser307磷酸化显著受抑。第二部分：与模型组比较,：NC 150,75 mg/kg剂量组可显著降低链佐菌素诱导的糖尿病模型大鼠空腹血糖、餐后血糖升高,增强糖尿病模型大鼠的葡萄糖耐受能力。实验期间,未见糖尿病大鼠行为活动异常现象。第三部分：JNC40、80、160 mg/kg剂量下可显著降低糖尿病大鼠空腹血糖(Fasting Blood Glucose, FBG),餐后血糖(Postprandial Blood Glucose, PBG)、糖化血红蛋白(Glycosylated Hemoglobulin A1C, HbAlc);亦可下调总胆固醇(Total Cholesterol, TC).甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein-Cholesterol, LDL-C)、游离脂肪酸(Free Fatty Acid, FFA)、空腹血清胰岛素(Fasting Insulin, FINS)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)及胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment index for insulin resistance,HOMA-IR);上调肝糖原(Hepatic glycogen), GLUT-4表达,抑制IRS-1Ser307磷酸化水平,可有效改善糖尿病大鼠葡萄糖代谢及脂肪代谢。JNC各剂量组可有效改善模型大鼠受损的胰岛β细胞的形态,改善胰岛β细胞分泌胰岛素的功能。此外,JNC3个剂量通过减少自由基以及游离脂肪酸生成,可减轻肝细胞损伤,显著缓解肝肿大。结论1、JNC对胰岛素抵抗大鼠及IR细胞具有改善作用,能有效增强机体与细胞对葡萄糖的消耗能力,推测该作用与JNC上调肝脏GLUT-4蛋白表达,增强细胞P13K蛋白表达,抑制IRS-1丝氨酸磷酸化相关。2、JNC有效减少脂肪脂解,改善机体脂质代谢以及FFA代谢,从而降低机体循环FFA水平,改善了IR状态,此作用可能与抗氧化活性有关。
【关键词】：2型糖尿病 胰岛素抵抗 葡萄糖转运体-4 胰岛素受体底物-1 磷酸酰肌醇-3-激酶 锦南复方
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R285.5;R-332
【目录】：

• 摘要2-5
• Abstract5-11
• 符号说明11-12
• 前言12-14
• 第一章 锦南复方改善HepG2细胞胰岛素抵抗14-22
• 1. 材料14-16
• 1.1 药品与试剂14-15
• 1.2 仪器15-16
• 2 方法16-18
• 2.1 HepG2细胞培养16
• 2.2 锦南复方对HepG2细胞增殖的影响16
• 2.3 建立HepG2 IR细胞模型16
• 2.4 鉴定HepG2 IR细胞模型16
• 2.5 总蛋白提取16
• 2.6 锦南复方对HepG2 IR模型细胞葡萄糖消耗的影响16-17
• 2.7 锦南复方对IR HepG2细胞GLUT-4,p-IRS-1 Ser307及PI3K蛋白表达的影响17-18
• 2.8 统计学方法18
• 3. 结果18-20
• 3.1 锦南复方对HepG2细胞增殖的影响18
• 3.2 胰岛素诱导HepG2细胞建立IR模型18-19
• 3.3 锦南复方对HepG2 IR细胞葡萄糖的影响19
• 3.4 锦南复方对胰岛素抵抗细胞IRS-1 Ser307磷酸化的影响19
• 3.5 锦南复方对胰岛素抵抗细胞PI3K表达的影响19-20
• 3.6 锦南复方对胰岛素抵抗细胞GLUTM表达的影响20
• 4. 小结20-22
• 第二章 锦南复方对链脲佐菌素诱导糖尿病模型大鼠血糖的影响22-28
• 1. 材料22-23
• 1.1 药物与试剂22
• 1.2 仪器22-23
• 1.3 动物23
• 2. 方法23-24
• 2.1 建立链佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型23
• 2.2 分组、干预及样本处理23
• 2.3 指标检测及方法23
• 2.4 口服糖耐量实验23-24
• 2.5 数据分析24
• 3 结果24-27
• 3.1 锦南复方对糖尿病大鼠空腹血糖的影响24
• 3.2 锦南复方对糖尿病大鼠餐后血糖的影响24-25
• 3.3 锦南复方对糖尿病模型大鼠口服糖耐量的影响25-26
• 3.4 锦南复方对糖尿病模型大鼠脏器系数的影响26-27
• 4. 小结27-28
• 第三章 锦南复方对胰岛素抵抗模型大鼠血糖及肝脏相关蛋白表达的影响28-42
• 1. 材料28-29
• 1.1 药物与试剂28-29
• 1.2 仪器29
• 1.3 动物29
• 2. 方法29-32
• 2.1 建立2型糖尿病大鼠模型29-30
• 2.2 分组、给药及样本处理30
• 2.3 指标检测及方法30
• 2.4 口服糖耐量实验30
• 2.5 肝糖原含量测定30-31
• 2.6 石蜡切片制作及处理31
• 2.7 H&E染色31
• 2.8 免疫组化法检测肝脏组织相关蛋白表达31-32
• 2.9 数据分析32
• 3 结果32-41
• 3.1 锦南复方对大鼠糖化血红蛋白、血糖、肝糖原的影响32-33
• 3.2 锦南复方对大鼠血脂水平的影响33-34
• 3.3 锦南复方对大鼠空腹血清胰岛素、胰岛素抵抗指数、游离脂肪酸的影响34-35
• 3.4 锦南复方对大鼠血清丙二醛、谷胱甘肽水平的影响35-36
• 3.5 锦南复方对糖尿病模型大鼠体重、摄食量、饮水量的影响36-37
• 3.6 锦南复方对大鼠口服糖耐量的影响37
• 3.7 锦南复方对大鼠肝脏GLUT-4蛋白表达的影响37-39
• 3.8 锦南复方对大鼠肝脏p-IRS-1 Ser307蛋白表达的影响39-40
• 3.9 锦南复方对大鼠胰岛β细胞形态的影响40
• 3.10 锦南复方对大鼠肝脏组织病理形态变化的影响40-41
• 4. 小结41-42
• 讨论42-46
• 参考文献46-51
• 文献综述51-65
• 参考文献59-65
• 致谢65-66
• 攻读学位期间发表的学术论文目录66-67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：523236