载脂蛋白A-I突变体重组高密度脂蛋白对转录因子ATF3的影响

发布时间：2017-07-06 13:09

  本文关键词：载脂蛋白A-I突变体重组高密度脂蛋白对转录因子ATF3的影响

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【摘要】：背景:ATF3在抑制炎症信号中通过抑制TLR的产生而发挥重要作用,高密度脂蛋白(HDL)或其主要蛋白成份Apo A-I具有显著的抗炎症作用。本研究探讨载脂蛋白A-I(Apo A-I)及其半胱氨酸突变体重组高密度脂蛋白对ATF3表达量的影响。方法:(1)利用pET原核表达系统表达载脂蛋白A-I74,A-I228,A-Im和A-IWT,亲和层析纯化后,加入DPPC,制作成重组高密度脂蛋白。(2)培养RAW264.7细胞,LPS刺激诱导炎症细胞模型,然后给于重组高密度脂蛋白干预,ELISA试剂盒检测炎症因子IL-6和TNF-α的表达水平,观察细胞形态学的改变,RT-PCR和western blotting检测细胞中转录激活因子ATF3 m RNA和蛋白表达水平的变化。结果:细胞形态学观察发现,与正常组比较,LPS组与rHDL228组细胞形态趋向于巨噬细胞化并出现降解,rHDL74、rHDLM和rHDLWT对LPS刺激的细胞有不同的保护作用。ELISA检测发现,rHDL74、rHDLm和rHDLwt中TNF-ɑ与IL-6的表达水平恢复到接近空白对照组水平,rHDL 228组TNF-ɑ与IL-6水平较较空白对照组明显升高(p0.01)。rHDL74、rHDLM和rHDLWT中TNF-ɑ与IL-6水平较LPS组明显降低(P0.01)。Western blotting结果显示,与对照组相比,LPS组与rHDL 228组ATF3的表达水平下降,具有显著性差异(p0.01)。rHDL74、rHDLM和rHDLWT组表达水平明显升高且差异显著(p0.05)。结论:重组高密度脂蛋白rHDL74、rHDLWT、rHDLM促进ATF3在m RNA和蛋白水平上的表达。而rHDL228下调其表达。
【关键词】：重组高密度脂蛋白 炎症反应 脂多糖 RAW264.7 细胞 ATF3
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R364.5
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 引言7-9
• 第一章 实验材料9-13
• 1.1 细胞株9
• 1.2 菌株9
• 1.3 实验器材9-10
• 1.4 主要试剂耗材10
• 1.5 主要试剂配制10-11
• 1.6 Western blotting试剂配制11-13
• 第二章 实验方法13-26
• 2.1 IPTG诱导大肠杆菌中目的蛋白的表达及纯化13-17
• 2.1.1 大肠杆菌的复苏13-14
• 2.1.2 用Ni2+亲和柱对重组载脂蛋白进行纯化14
• 2.1.3 分析表达的目的蛋白为何种形式存在14
• 2.1.4 对浓缩后蛋白进行透析和蛋白浓度的测定14-15
• 2.1.5 BCA法测蛋白15-16
• 2.1.6 树脂再生16
• 2.1.7 重组蛋白去内毒素16-17
• 2.1.8 脂质体的包装17
• 2.2 重组高密度脂蛋白抗炎作用的研究17-24
• 2.2.1 实验细胞17-18
• 2.2.2 实验分组18
• 2.2.3 细胞形态学观察18
• 2.2.4 荧光定量PCR引物设计18-19
• 2.2.5 总RNA的提取19
• 2.2.6 RNA琼脂糖电泳检测RNA纯度和完整性19
• 2.2.7 cDNA的合成方法19-21
• 2.2.8 Real-time PCR检测mRNA相对表达21
• 2.2.9 ELISA试剂盒检测细胞培养夜中TNF-α 和IL-6 炎症因子的表达21-22
• 2.2.10 Western blot检测ATF3在不同的重组HDL中的表达情况22-24
• 2.3 统计学方法检测24-26
• 第三章 实验结果26-31
• 3.1 重组高密度脂蛋白的表达纯化分析26
• 3.2 RAW264.7 细胞经LPS刺激后加入不同的高密度脂蛋白处理后细胞的形态学变化26-27
• 3.3 重组高密度脂蛋白对细胞培养液中炎症因子TNF-ɑ和IL-6 表达水平的影响27-28
• 3.4 不同高密度脂蛋白对RAW264.7 细胞中ATF3 mRNA相对表达量的影响28-29
• 3.5 不同高密度脂蛋白对RAW264.7 细胞中ATF3mRNA相对表达量的影响29-31
• 第四章 讨论31-34
• 结论34-35
• 参考文献35-41
• 综述41-64
• 参考文献51-64
• 攻读学位期间的研究成果64-65
• 英文缩略词表65-67
• 致谢67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 钟巧青;赵水平;董静;吴智鸿;谢湘竹;于碧莲;董劭壮;;高密度脂蛋白对炎症状态下脂肪细胞功能的保护作用[J];中国药理学通报;2007年07期

2 钟巧青;赵水平;王星;于碧莲;董静;谢湘竹;吴智鸿;;高密度脂蛋白对3T3-L1脂肪细胞分泌白细胞介素8的影响[J];中华内分泌代谢杂志;2010年10期

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本文编号：526331