EGCG棕榈酸酯体外抗HCV作用及机理研究

发布时间：2017-07-07 02:16

  本文关键词：EGCG棕榈酸酯体外抗HCV作用及机理研究

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【摘要】：人类是地球上的重要成员,在影响环境的同时也被环境影响。病原体通过破坏人体内环境的稳态致使疾病发生。丙型肝炎病毒就是一种病毒性病原体,具有全球流行性的单链RNA病毒,根据其基因组变异区域的序列可将其分为6个基因型以及近百种基因亚型。病毒进入人体后有较长的潜伏期,特异性侵入肝细胞通过增殖改变细胞内环境的平衡,使细胞功能出现紊乱甚至丧失,由慢性肝炎逐渐发展为肝硬化、肝癌以及爆发性肝衰竭,导致肝功能的彻底丧失,最终夺走人类的生命。本研究通过对表没食子儿茶素没食子酸棕榈酸酯(EGCG棕榈酸酯)体外抗丙型肝炎病毒的效果的检测,确定EGCG棕榈酸酯的抗病毒作用。采用分子生物学的试验手段从细胞水平和分子水平探讨研究EGCG棕榈酸酯与肝细胞以及病毒三者之间相互作用的机理。首先,采用CCK-8试剂盒检测脂溶性EGCG棕榈酸酯对Huh7.5.1的毒性作用,丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒测量扩增病毒的滴度,实时荧光定量PCR检测用于实验的最佳病毒感染复数(multiple of infection, MOI),进而研究药物抗病毒的作用效果。通过免疫蛋白印记法(western bloting)检测EGCG棕榈酸酯对细胞干扰素通路STAT2蛋白的磷酸化水平作用,以及干扰热休克蛋白成员——HSPA5表达,检测EGCG棕榈酸酯抗病毒的作用效果,确定药物抗病毒的作用途径。结果：0-50μg/mL的EGCG棕榈酸酯对Huh7.5.1没有毒害作用,EGCG棕榈酸酯具有明显的预防细胞感染病毒以及抑制病毒增殖的作用,但是预防效果与药物添加浓度无明显相关性；而随药物浓度增加EGCG棕榈酸酯抑制病毒增殖的效果增强,当浓度为25μg/mL时抑制效果最佳,此时病毒表达量是阳性对照组表达量的1/6。研究还发现,低浓度药物持续刺激感染病毒的细胞能更大的降低病毒的增殖,同时,IFN-α的连续刺激感染细胞,丙型肝炎病毒的基因表达量是阴性对照的1/2,这很好的证明了临床上IFN-α对于丙肝患者治疗的有效率不足50%这一现象。我们推测EGCG棕榈酸酯能替代传统干扰素成为有效治疗药物治愈疾病。通过蛋白质免疫印迹实验发现EGCG棕榈酸酯能对STAT2蛋白进行磷酸化修饰,慢病毒包装干扰HSPA5蛋白的表达降低病毒的增殖,同时发现EGCG棕榈酸酯的抗病毒作用也有所降低。我们推测HSPA5是丙型肝炎病毒增殖过程中起着重要促进作用的宿主因子,干扰蛋白的表达则能大大降低病毒的增殖能力。EGCG棕榈酸酯的抗病毒作用可能是通过修饰STAT2激活干扰素通路的抗病毒基因表达正向抑制病毒的增殖,同时特异性与HSPA5结合降低蛋白的活性负向抑制病毒增殖,两条途径共同作用实现抗病毒作用的。由于细胞生存在微观与精密并存的环境中,EGCG棕榈酸酯实现细胞内抗病毒的作用的途径并非简单两个蛋白的改变而已,希望本研究为人类克服丙型肝炎病毒提供依据。
【关键词】：EGCG棕榈酸酯 丙型肝炎病毒 Huh7.5.1 293T 实时荧光定量PCR CCK-8试剂盒 转染 慢病毒包装
【学位授予单位】：广西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373.21
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 第1章 绪论9-17
• 1.1 引言9-11
• 1.2 课题来源11
• 1.3 研究背景11-13
• 1.3.1 感染者的全球分布11-12
• 1.3.2 传播途径及危害12-13
• 1.4 研究现状13-14
• 1.5 研究主要内容和目标14-17
• 第2章 各研究阶段的实验准备17-25
• 2.1 实验材料及仪器18-20
• 2.1.1 试验材料18
• 2.1.2 配制溶液18-19
• 2.1.3 购买试剂、仪器19-20
• 2.2 细胞常规培养20
• 2.3 实时荧光定量PCR20-21
• 2.4 制备大肠杆菌感受态21-22
• 2.5 蛋白质免疫印迹22-23
• 2.6 结果分析23-25
• 2.6.1 实时荧光定量PCR结果分析23-24
• 2.6.2 蛋白质免疫印迹24-25
• 第3章 毒性试验及病毒感染复数的测定25-31
• 3.1 实验材料及仪器26
• 3.2 EGCG棕榈酸酯的细胞毒性试验26
• 3.3 病毒扩增及浓度测定26-28
• 3.4 实验结果28-29
• 3.4.1 细胞毒性实验28
• 3.4.2 病毒浓度及感染复数测定28-29
• 3.5 讨论29-31
• 第4章 EGCG榈酸酯抗丙型肝炎病毒的作用31-35
• 4.1 材料31
• 4.2 药物抗病毒作用的检测31-32
• 4.3 结果32-33
• 4.4 讨论33-35
• 第5章 抗病毒机理研究——干扰素通路35-39
• 5.1 仪器和试剂36
• 5.2 干扰素通路启动子激活效果的检测36
• 5.3 蛋白质免疫印迹检测STAT236-37
• 5.4 结果37-38
• 5.4.1 启动子检测结果37
• 5.4.2 蛋白检测结果37-38
• 5.5 讨论38-39
• 第6章 抗病毒机理研究——HSPA5蛋白39-48
• 6.1 材料39-40
• 6.1.1 HSPA5干扰序列39
• 6.1.2 主要试剂39
• 6.1.3 质粒39-40
• 6.2 构建干扰质粒40-41
• 6.3 筛选干扰细胞系41-42
• 6.4 药物与病毒处理干扰细胞系42
• 6.5 结果42-46
• 6.5.1 质粒构建42-43
• 6.5.2 转染43-44
• 6.5.3 干扰效果的检测44-45
• 6.5.4 药物与病毒处理筛选细胞系45-46
• 6.6 讨论46-48
• 第7章 总结与讨论48-50
• 参考文献50-56
• 致谢56-57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 刘帅华;李春英;李朝;刘德曼;施昆明;赵春建;;EGCG及其衍生物的抗病毒作用研究进展[J];黑龙江医药;2013年01期

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本文编号：528578