卵转铁蛋白对树突状细胞成熟及免疫调节功能的影响

发布时间：2017-07-08 16:03

  本文关键词：卵转铁蛋白对树突状细胞成熟及免疫调节功能的影响

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【摘要】：卵转铁蛋白(OVT)是禽蛋蛋清蛋白中主要的成分,具有多种生物活性。OVT通过抗原递呈细胞进行外来物质(抗原)的吞噬处理和递呈作用,传递信息给免疫细胞,激活机体的先天性免疫系统,调节免疫细胞因子的产生,影响淋巴细胞增殖、T细胞的成熟与分化,在生物体内发挥着增强免疫功能、抵抗细菌和病毒感染的作用。树突状细胞(DCs)作为体内最强的抗原提呈细胞,能够将细胞内外抗原特异性呈递给幼稚型T细胞,引发机体免疫反应。目前尚未见OVT对DCs发育、成熟、迁移及免疫调节分子等的影响报道。本文通过体外培养小鼠骨髓来源树突状细胞,流式细胞仪检测不同浓度OVT刺激下DCs表面特征性分子表达量,ELISA测定细胞培养上清液中细胞因子水平变化,MLRs测定成熟DCs引发同种异体小鼠脾脏T细胞增殖效果,Western-blot测定MAPK通路下p38MAPK、JNK和ERK以及它们的磷酸化蛋白含量,探讨OVT对DCs成熟和免疫调节的影响,为后续的试验提供理论依据。研究结果如下:(1)不同浓度(10、25、50、100、200μg/mL)OVT单独刺激DCs 48 h后,均能显著提高DCs表面CD80、CD40和MHC-II分子表达量,促进DCs的成熟;不同浓度OVT与LPS共同刺激DCs 48 h后,10~25μg/mL(低浓度)OVT刺激的DCs表面CD80、CD40和MHC-II分子表达量显著高于阳性对照组(LPS单独刺激组),表现为协同LPS刺激效果,25~200μg/m L(高浓度)OVT刺激的DCs表面CD80、CD40和MHC-II分子表达量显著低于阳性对照组,表现为拮抗LPS刺激效果。因而,OVT单独刺激或与LPS共刺激DCs均表现出促进DCs成熟的效果,但共刺激下高浓度会减弱DCs的成熟度。(2)不同浓度OVT单独刺激成熟的DCs均能够引发同种异体小鼠脾脏T淋巴细胞增殖,不同浓度OVT在DCs:T细胞=1:25时,T细胞增殖率最高;LPS与不同浓度OVT共同刺激成熟的DCs在低浓度OVT时能显著引发T细胞增殖,但高浓度OVT对T细胞的增殖无显著影响。以上结果表明,OVT单独刺激或低浓度与LPS共刺激成熟的DCs显著引发T淋巴细胞增殖,但高浓度共刺激DCs无引发T细胞增殖的能力。(3)不同浓度OVT单独刺激DCs 48 h后,DCs培养上清液中TNF-α含量随浓度增加而升高,但在200μg/mL时,显著下降;IL-10的表达量在200μg/m L时达到最大;IL-12p70的表达量不依赖OVT的剂量,在细胞上清液中大量存在,且与对照组无显著差异,表明OVT单独刺激下促炎反应占主导,在浓度最高时抗炎反应起主导作用,抑制炎症的继续发展,但IL-12p70的表达量呈现不依赖OVT浓度。(4)LPS与不同浓度OVT共刺激DCs 48 h,细胞上清中TNF-α含量呈现先升高后下降的趋势,25μg/m L OVT为转折点。IL-10含量随OVT浓度增加上调,在OVT浓度为200μg/m L时达到最大,共刺激DCs产生的IL-12p70显著高于单独刺激各组,但共刺激组别间无显著差异。表明OVT与LPS共刺激下低浓度时主要发生促炎反应,高浓度时抗炎反应占主导地位且依赖OVT浓度,IL-12p70总体呈现不依赖共刺激物,但显著高于OVT单独刺激组的释放量。(5)25μg/m L OVT单独刺激DCs一定时间(4 h、8h、12 h)后,检测MAPK信号路径下的p38MAPK、ERK、JNK及它们的磷酸化蛋白表达量,结果表明:OVT单独刺激DCs时,ERK、p-ERK表达量下调,p-p38MAPK、JNK,p-JNK表达量上调,揭示OVT单独刺激DCs的成熟依赖p-p38MAPK、ERK和JNK路径;LPS与25μg/mL OVT刺激DCs后,DCs内p38MAPK、p-p38MAPK、JNK和p-JNK表达量上调,ERK蛋白和p-ERK蛋白表达量下调,表明LPS与OVT共刺激DCs的成熟依赖p38MAPK、JNK和ERK三条路径。
【关键词】：卵转铁蛋白 树突状细胞 表型 细胞因子 混合淋巴细胞反应 蛋白免疫印迹
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 缩略词10-11
• 第1章 文献综述11-22
• 1.1 卵转铁蛋白国内外研究概况11-14
• 1.1.1 卵转铁蛋白的结构和理化性质11-12
• 1.1.2 卵转铁蛋白的生理活性12-14
• 1.1.2.1 转运铁离子12-13
• 1.1.2.2 抗菌抗病毒活性13
• 1.1.2.3 抗氧化作用13
• 1.1.2.4 免疫调节功能13-14
• 1.1.2.5 抗肿瘤作用14
• 1.2 树突状细胞的生物学特性14-17
• 1.2.1 DCs的来源和分布14-15
• 1.2.2 DCs的表型15
• 1.2.3 DCs对抗原的加工和递呈能力15-16
• 1.2.3.1 外源性抗原的加工和呈递——溶酶体途径15-16
• 1.2.3.2 内源性抗原的加工和递呈——蛋白酶体途径16
• 1.2.3.3 交叉递呈16
• 1.2.4 DCs的分泌物16-17
• 1.2.5 DCs的迁移17
• 1.2.6 DCs的免疫调节功能17
• 1.2.7 DCs与免疫治疗17
• 1.3 DCS的体外培养17-18
• 1.3.1 骨髓源DCs培养方法的建立18
• 1.3.2 树突状细胞培养中纯化方法的优化18
• 1.4 树突状细胞的信号转导途径18-20
• 1.5 卵转铁蛋白对树突状细胞成熟及免疫调节功能的研究进展20-21
• 1.6 课题来源及研究目的与意义21-22
• 1.6.1 课题来源21
• 1.6.2 研究目的与意义21-22
• 第2章 卵转铁蛋白对树突状细胞成熟的影响22-29
• 2.1 试验材料与仪器22-23
• 2.1.1 试验动物22
• 2.1.2 试剂22
• 2.1.3 主要仪器设备22-23
• 2.2 试验方法23-24
• 2.2.1 试剂配制23
• 2.2.2 DCs的分离纯化23
• 2.2.3 OVT对DCs细胞毒性试验23-24
• 2.2.4 OVT对细胞表型的影响24
• 2.2.5 统计学分析24
• 2.3 结果与讨论24-28
• 2.3.1 OVT对DCs的细胞毒性实验24-25
• 2.3.2 OVT对DCs形态的影响25-26
• 2.3.3 OVT对DCs表型的影响26-28
• 2.4 小结28-29
• 第3章 卵转铁蛋白对DCS刺激T细胞增殖的研究29-35
• 3.1 试验材料与仪器29-30
• 3.1.1 试验动物29
• 3.1.2 试验试剂和耗材29-30
• 3.1.3 试验设备30
• 3.2 试验方法30-31
• 3.2.1 OVT刺激DCs成熟30
• 3.2.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离30
• 3.2.3 成熟DCs引发混合淋巴细胞反应(MLRs)30-31
• 3.2.4 统计学分析31
• 3.3 试验结果及讨论31-34
• 3.3.1 不同浓度OVT刺激成熟的DCs引发同种异体T细胞增殖的能力31-32
• 3.3.2 LPS与不同浓度OVT刺激成熟的DCs引发同种异体T细胞增殖的能力32-34
• 3.4 小结34-35
• 第4章 卵转铁蛋白对DCS细胞因子及信号分子的影响35-51
• 4.1 试验材料与设备35-36
• 4.1.1 试验动物35
• 4.1.2 试验试剂及耗材35-36
• 4.1.3 试验设备36
• 4.2 试验方法36-40
• 4.2.1 试验试剂配制36-37
• 4.2.2 DCs细胞上清液中细胞因子的测定37-38
• 4.2.3 成熟DCs蛋白的提取38
• 4.2.4 蛋白含量的测定38
• 4.2.5 蛋白变性38
• 4.2.6 SDS-PAGE的制备38
• 4.2.7 电泳38-39
• 4.2.8 湿法转膜及检测39
• 4.2.9 封闭39
• 4.2.10孵育抗体和DAB显色39-40
• 4.2.11凝胶成像分析及数据分析40
• 4.3 结果与讨论40-50
• 4.3.1 TNF-α 细胞因子的表达量40-41
• 4.3.1.1 TNF-α 标曲的绘制40
• 4.3.1.2 OVT单独刺激成熟的DCs产生TNF-α 的量40-41
• 4.3.1.3 LPS与不同浓度OVT共刺激DCs产生TNF-α 的量41
• 4.3.2 IL-10含量测定41-43
• 4.3.2.1 IL-10标准曲线的绘制41-42
• 4.3.2.2 OVT单独刺激DCs产生IL-10的量42
• 4.3.2.3 LPS与不同浓度OVT共刺激DCs产生IL-10的量42-43
• 4.3.3 IL-12p70含量的测定43-45
• 4.3.3.1 IL-12p70标准曲线绘制43-44
• 4.3.3.2 不同浓度OVT单独刺激DCs产生IL-12p70的量44
• 4.3.3.3 LPS与不同浓度OVT共刺激DCs产生IL-12p70的量44-45
• 4.3.4 MAPK信号传导路径中三种蛋白质及其磷酸化蛋白含量测定45-50
• 4.3.4.1 总蛋白提取纯度及完整性检测45-46
• 4.3.4.2 p38MAPK和p-p38MAPK蛋白凝胶成像图和定量分析46-47
• 4.3.4.3 JNK和p-JNK蛋白含量的凝胶成像图和定量分析47-48
• 4.3.4.4 ERK和p-ERK蛋白含量的凝胶成像图和定量分析48-50
• 4.4 小结50-51
• 结论与展望51-52
• 1 结论51
• 2 展望51-52
• 参考文献52-60
• 致谢60-61
• 攻读硕士学位期间的研究成果61
• 1、论文发表情况61
• 2、参与科研项目情况61

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6 包晶晶;林海霞;马t，

本文编号：535244