补肾生髓法联合BMSCs移植对D-半乳糖致衰老大鼠CyclinD、CDK4及pRb磷酸化状态的影响

发布时间：2017-07-21 04:16

  本文关键词：补肾生髓法联合BMSCs移植对D-半乳糖致衰老大鼠CyclinD、CDK4及pRb磷酸化状态的影响

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【摘要】：目的:研究补肾生髓方联合骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植对D-半乳糖致衰老大鼠周期蛋白D(CyclinD)、周期蛋白依赖性蛋白激酶4(Cyclin-dependent protein kinases,CDK4)、视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma,Rb)基因表达产物-pRb磷酸化状态的影响,初步探讨补肾生髓法联合BMSCs移植延缓衰老的作用及机制。方法:(1)大鼠颈背部皮下注射10%D-半乳糖制备亚急性衰老模型,通过与自然衰老大鼠组、青年大鼠组比较老化度评分、测定大鼠血清超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醇(Malondialdehyde malonic dialdehyde propanedial,MDA)含量评判大鼠衰老模型制备成功与否。(2)采用密度梯度离心法结合贴壁分离筛选法体外培养BMSCs。(3)亚急性衰老模型大鼠随机分为四组:甲组(模型组)、乙组(补肾生髓方组)、丙组(补肾生髓方+BMSCs移植组)、丁组(BMSCs移植组),各组进行相应干预后,比较各组老化度评分,取大鼠血清测定SOD活性和MDA含量,取大鼠海马组织采用免疫组化法检测CyclinD、CDK4及pRb磷酸化表达状态。结果:(1)亚急性衰老模型大鼠老化度评分均上升,SOD活性显著降低,MDA含量均升高,与自然衰老大鼠组对比组间差异无统计学意义(P0.05),与青年大鼠组比较组间差异有统计学意义(P0.05),亚急性衰老模型制备成功。(2)通过形态学观察,原代培养的BMSCs贴壁生长,单个呈长梭形或多角形,集落分布,P3、P4、P5 BMSCs生长曲线均近似“S”形,流式细胞仪检测P3 BMSCs表面标记物CD71、CD44阳性率均达到95%以上,传代培养细胞符合实验要求。(3)亚急性衰老模型大鼠进行不同干预后,四组老化度评分、SOD活性、MDA含量及CyclinD、CDK4、pRb磷酸化状态的阳性表达率结果比较,组间差异均有统计学意义(P0.05);组间两两比较,与甲组比较,乙组、丙组、丁组老化度评分均有所下降,SOD活性均有上升,MDA含量下降,CyclinD、CDK4、pRb磷酸化状态的阳性表达率均上升,组间差异均有统计学意义(P0.05);乙、丙、丁三组间比较,组间差异均有统计学意义(P0.05),其中丙组的老化度评分下降、SOD活性上升、MDA含量下降程度最明显,CyclinD、CDK4、pRb磷酸化状态的阳性表达率分别达90%、90%、80%。结论:补肾生髓法联合BMSCs移植能有效地延缓衰老,其可能通过影响CyclinD-CDK4-pRb细胞通路的传导与调控发挥作用。
【关键词】：补肾生髓方 骨髓间充质干细胞移植 D-半乳糖 延缓衰老 周期蛋白D 周期蛋白依赖性蛋白激酶4 视网膜母细胞瘤基因表达产物pRb磷酸化状态
【学位授予单位】：湖南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R339.38
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 引言10-12
• 第一部分 实验材料12-14
• 1.1 实验动物12
• 1.2 实验药物12
• 1.3 实验细胞12
• 1.4 实验试剂12-13
• 1.5 实验仪器与设备13-14
• 第二部分 实验方法14-18
• 2.1 衰老大鼠模型的制备14
• 2.2 大鼠BMSCs的提取、传代培养及观察、鉴定14-15
• 2.2.1 大鼠BMSCs的提取14
• 2.2.2 大鼠BMSCs的传代与培养14-15
• 2.2.3 大鼠BMSCs的细胞生长曲线的绘制15
• 2.2.4 流式细胞仪检测BMSCs表面标记物15
• 2.3 实验分组及干预因素15-16
• 2.4 检测指标及方法16-17
• 2.4.1 老化度评分表16
• 2.4.2 大鼠血清SOD活性与MDA含量16
• 2.4.3 大鼠海马CyclinD、CDK4、pRb磷酸化状态检测16-17
• 2.5 统计学处理17-18
• 第三部分 实验结果与分析18-25
• 3.1 老化度评分结果18-19
• 3.2 大鼠BMSCs的观察及鉴定19-20
• 3.2.1 大鼠BMSCs的形态学特征19-20
• 3.2.2 大鼠BMSCs的细胞生长曲线20
• 3.2.3 大鼠BMSCs的表面标记物20
• 3.3 大鼠血清SOD活性及MDA含量20-22
• 3.4 大鼠海马CyclinD、CDK4、pRb磷酸化状态22-25
• 3.4.1 大鼠海马Cyclin D的表达状态22
• 3.4.2 大鼠海马CDK4的表达状态22-23
• 3.4.3 大鼠海马pRb磷酸化表达状态23-25
• 第四部分 讨论25-32
• 4.1 补肾生髓法延缓衰老的理论依据25
• 4.2 补肾生髓方的组方依据25-26
• 4.3 现代医学对于衰老的认识26
• 4.4 骨髓间充质干细胞延缓衰老的理论依据26-28
• 4.5 大鼠骨髓间充质干细胞的移植28
• 4.6 D-半乳糖致大鼠衰老的理论依据28-29
• 4.7 SOD活性与MDA含量检测的意义29-30
• 4.8 CyclinD、CDK4、pRb磷酸化状态的意义30-31
• 4.9 前景与展望31-32
• 结论32-33
• 参考文献33-37
• 缩略词表37-38
• 致谢38-39
• 综述39-52
• 参考文献48-52

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本文编号：571390