狂犬病病毒M蛋白与细胞传播性相关的功能位点分析

发布时间：2017-07-29 12:17

  本文关键词：狂犬病病毒M蛋白与细胞传播性相关的功能位点分析

  更多相关文章： 狂犬病病毒 M蛋白 反向遗传技术 细胞间传播能力 Ⅰ型干扰素

【摘要】：狂犬病病毒(Rabies virus, RABV)具有严格的神经嗜性,可导致中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)发生退行性疾病,死亡率居高不下,全球每年因其死亡人数高达70,000人,是全社会必须关注的公共卫生问题。目前只能做好暴露前和暴露后预防才能有效控制狂犬病病毒的传播,除加强对人的免疫外,同时亦要加强对家养及野生动物的管理。狂犬病病毒基因组拥有5个开放阅读框(Open Reading Frame, ORF),依次编码N、P、M、G和L蛋白,其中M蛋白参与病毒的出芽与释放,同时具有调节病毒转录与复制的作用。本研究小组先前选取广西的街毒株GX01株为研究对象,探索其M基因对病毒生物学特性的影响。GX01株为广西分离强毒株,脑内注射能100%致死成年小鼠。选取日本动物用狂犬病疫苗株RC-HL株的全长感染性cDNA克隆为骨架,RC-HL株为实验室固定的弱毒株,不致死成年小鼠。将GX01株M基因的44-46位氨基酸区域替换到rRC-HL的相应位置,证实可明显地影响病毒在细胞间的传播特性为进一步查明导致狂犬病病毒在细胞间传播性降低的功能性氨基酸,针对M蛋白44和46位氨基酸残基分别进行F44L、S46G和F44L/S46G突变,运用反向遗传技术拯救出3个突变病毒,即rRC-HL(M44)株、rRC-HL(M46)株和rRC-HL (M44/46)株,然后测定其在细胞间的传播特性。对亲本病毒rRC-HL株、重组病毒rRC-HL (GX01M)株、突变病毒rRC-HL (M44)株、rRC-HL (M46)株和rRC-HL (M44/46)株及强毒株GX01株进一步测定其生物学特性。实验表明,在BSR/T7-9细胞上,重组病毒rRC-HL (GX01M)株和突变病毒rRC-HL (M44/46)株的病毒滴度显著低于亲本病毒rRC-HL株的病毒滴度,而高于强毒株GX01株。通过空斑试验表明亲本毒株rRC-HL株在BSR/T7-9细胞间的传播能力最强,rRC-HL(GX01M)株、rRC-HL(M44)株、rRC-HL(M46)株和rRC-HL (M44/46)株分别比亲本病毒rRC-HL株低1.8、1.5、1.3、2.6倍,街毒株GX01株比rRC-HL株低15.6倍,传播能力最低。这些结果说明M蛋白的F44L/S46G联合突变能够显著降低病毒在细胞间的传播能力。各病毒株感染BSR/T7-9细胞48 hpi时,亲本毒株rRC-HL株和rRC-HL (M46)株可诱导产生明显的细胞病变(CPE),rRC-HL (M44)株可产生轻度的CPE,但是突变株rRC-HL (GX01M)株、rRC-HL (M44/46)株与GX01株一样不诱导产生CPE,说明M蛋白的F44L/S46G联合突变可明显降低病毒产生CPE。重组病毒rRC-HL (GX01M)株、rRC-HL (M44)株、rRC-HL (M46)株和rRC-HL (M44/46)株与亲本病毒rRC-HL株一样不致死成年小鼠,只是造成小鼠4-8 d体重下降,之后恢复至正常水平,GX01株在第7天全部致死小鼠。说明GX01株的M蛋白不是主要毒力决定因子,M蛋白的F44L/S46G联合突变亦不能明显增强致病性。各病毒株以0.1 MOI的病毒量感染BSR/T7-9细胞后,rRC-HL (M46)株与rRC-HL株的N和M基因mRNA水平相似,高于其他病毒株,其中突变病毒rRC-HL (M44/46)株的N和M基因mRNA水平下降较明显,仅次于街毒株GX01株。N和M蛋白水平与mRNA水平保持一致,rRC-HL株与rRC-HL (M46)株的N和M蛋白表达量均较高,rRC-HL (GX01M)株和rRC-HL (M44)株次之,rRC-HL(M44/46)株的N和M蛋白表达量显著低于rRC-HL株,与先前的rRC-HL(GX01M2)株结果相似,GX01株的蛋白表达量最低。狂犬病弱毒株rRC-HL株、rRC-HL (GX01M)株、rRC-HL (M44)株、rRC-HL (M46)株和rRC-HL (M44/46)株均能在RAW264.7细胞及TLR3敲除的RAW264.7细胞(RAW264.7 TLR3-/-细胞)上生长,而GX01株在RAW264.7细胞中受到高度的抑制。TLR3敲除后致使各病毒滴度均下降,但在这两种细胞中的病毒滴度均显著低于在BSR/T7-9细胞。各病毒株在RAW264.7细胞及RAW264.7 TLR3-/-细胞中mRNA和蛋白表达水平与在B SR/T7-9细胞中的趋势相似。用ELISA方法检测各病毒株感染细胞后诱导产生的I型干扰素(I型IFN)的含量,发现在RAW264.7细胞中12 hpi时只有rRC-HL(M44/46)株能够产生较高水平的IFN-α/β;在24 hpi时除GX01株外,其他毒株均诱导产生IFN-α/β,然而,rRC-HL(M44/46)株诱导产生的IFN-α/β水平仍是最高的,IFN-α和IFN-β分别达到了2212.17 pg/mL和2036.66 pg/mL。在R AW264.7 TLR3-/-细胞中,感染病毒12 hpi时,rRC-HL(GX01M)株、rRC-HL(M44)株和rRC-HL(M44/46)株产生较高水平的IFN-α/β,IFN-α分别达到了532.5、2070.5和2168.6 pg/mL；除了GX01株外,各病毒株在24 hpi时诱导产生的IFN-α/β水平几乎一样。这些结果表明,GX01株的M基因替换rRC-HL株M基因后能够诱导高水平IFN-α/β的产生,而M蛋白的F44L/S46G联合突变是决定M蛋白诱导产生高水平IFN-α/β的主要原因；在正常的RAW264.7细胞与RAW264.7 TLR3-/-细胞中均能产生IFN-α/β说明TLR3的敲除不影响病毒诱导IFN-α/β的产生。在RAW264.7细胞和R AW264.7 TLR3-/-细胞中,感染各病毒株后诱导产生的抗病毒蛋白Viperin的量均与IFN-α/β的量呈正相关,这说明IFN-α/β通过诱导Viperin蛋白的表达,从而使细胞进入抗病毒状态。感染各病毒株后IRF3的蛋白水平与IFN-α/β和Viperin的表达量相一致,说明IRF3参与了调节IFN-α/β的产生过程。感染狂犬病病毒后,NF-κB在RAW264.7细胞上有所上调,但在正常的RAW264.7细胞和R AW264.7 TLR3-/-细胞表现不说明NF-κB对IFN-α/β的产生不是必须的,有待进一步验证NF-αB对诱导IFN-α/β的影响；MyD88无显著变化,不介导IFN-α/β的产生。
【关键词】：狂犬病病毒 M蛋白 反向遗传技术 细胞间传播能力 Ⅰ型干扰素
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65;R373
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-15
• 第一章 文献综述15-30
• 1.1 狂犬病病毒的形态结构15-17
• 1.1.1 狂犬病病毒的形态结构15-16
• 1.1.2 狂犬病病毒的基因组结构16-17
• 1.2 狂犬病病毒的转录与复制17-18
• 1.3 狂犬病病毒M基因的相关研究18-23
• 1.3.1 M蛋白的结构18
• 1.3.2 M蛋白与病毒装配、出芽及释放18-19
• 1.3.3 影响病毒出芽的M蛋白决定区域研究19-21
• 1.3.4 M蛋白与病毒转录和复制21-22
• 1.3.5 M蛋白与细胞凋亡的关系22-23
• 1.4 狂犬病病毒与细胞因子的研究23-25
• 1.4.1 狂犬病病毒与趋化因子23-24
• 1.4.2 狂犬病病毒与干扰素24-25
• 1.5 狂犬病病毒的反向遗传学研究及应用25-28
• 1.5.1 狂犬病病毒的反向遗传学研究系统25-26
• 1.5.2 狂犬病病毒的反向遗传学应用26-28
• 1.6 开展本研究的目的与意义28-30
• 第二章 狂犬病病毒M蛋白与细胞传播性相关的功能位点分析30-51
• 2.1 材料30-33
• 2.1.1 细胞、病毒和小鼠30
• 2.1.2 质粒30-31
• 2.1.3 主要仪器和试剂31
• 2.1.4 引物设计与合成31-33
• 2.2 方法33-36
• 2.2.1 狂犬病突变病毒cDNA感染性克隆的构建33
• 2.2.2 狂犬病突变病毒的拯救33-34
• 2.2.3 间接免疫荧光试验鉴定拯救的突变病毒34
• 2.2.4 种毒的制备及毒价测定34-35
• 2.2.5 突变病毒M基因的鉴定35
• 2.2.6 多步生长曲线的测定35
• 2.2.7 病毒的空斑形成试验35
• 2.2.8 病毒的致病性实验35
• 2.2.9 蛋白免疫印迹实验(Western Blot)35-36
• 2.2.10 实时荧光定量PCR(qPCR)36
• 2.3 结果36-47
• 2.3.1 感染性cDNA克隆的构建36-38
• 2.3.2 突变病毒的拯救38
• 2.3.3 突变病毒滴度的测定38-39
• 2.3.4 M基因突变位点序列鉴定39-40
• 2.3.5 拯救的狂犬病病毒生长特性40-41
• 2.3.6 突变病毒在细胞与细胞间的传播能力41-42
• 2.3.7 突变病毒对细胞的影响42-43
• 2.3.8 突变病毒对小鼠的致病性43-44
• 2.3.9 突变病毒的蛋白水平变化44-45
• 2.3.10 突变病毒N和M基因的转录水平45-47
• 2.4 讨论47-50
• 2.5 小结50-51
• 第三章 狂犬病病毒M蛋白介导的Ⅰ型干扰素应答51-78
• 3.1 材料与方法51-53
• 3.1.1 细胞、病毒51
• 3.1.2 主要试剂与仪器51
• 3.1.3 引物设计51-52
• 3.1.4 ELISA检测IFN-α和IFN-β的操作步骤52-53
• 3.2 结果53-72
• 3.2.1 狂犬病病毒在RAW264.7细胞中的生长情况、mRNA水平与蛋白水平53-56
• 3.2.2 狂犬病病毒在RAW264.7 TLR3~(-/-)细胞中的生长情况、mRNA水平与蛋白水平56-58
• 3.2.3 狂犬病病毒在不同细胞上转录能力的比较58-60
• 3.2.4 突变病毒诱导Ⅰ型IFN的产生60-63
• 3.2.5 突变病毒诱导IFN刺激基因Viperin的产生63-66
• 3.2.6 突变病毒诱导Ⅰ型IFN产生的相关基因分析66-69
• 3.2.7 感染狂犬病病毒的小鼠脑组织IFN-α/β的产生情况69-72
• 3.3 讨论72-77
• 3.4 小结77-78
• 第四章 结论78-79
• 参考文献79-89
• 致谢89

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