EGCG诱导PC12细胞凋亡及调节APP分解代谢的作用机制研究

发布时间：2017-07-29 17:15

  本文关键词：EGCG诱导PC12细胞凋亡及调节APP分解代谢的作用机制研究

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【摘要】：目的：表观遗传学是指在DNA序列没有发生改变的情况下,生物体的基因的表型发生变化,同时这种基因表型的改变可以在细胞生长、增殖的过程当中发生稳定遗传。表观遗传学主要包括DNA以及与其密切相关的蛋白,非编码RNA等,能够在基因表达的过程中的多个环节发挥作用,例如DNA的甲基化、组蛋白的修饰作用、染色质的重塑、遗传印记以及RNA的表达水平。目前,越来越多的研究表明,表观遗传学可能贯穿疾病发生发展的整个过程的始终,尤其是在阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease, AD)与肿瘤这两种疾病中,也有研究表明导致AD发生的关键蛋白—淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)在肿瘤中也呈现高表达状态,这种基因的高表达可能与肿瘤的发生、发展、转移有一定的关系。那么是不是也就意味着通过抑制APP在两种疾病中的高表达状态就可以寻找出同时治疗两种疾病的突破口呢?表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)是茶叶中含量极高的重要的一种儿茶素类化合物,目前研究数据表明EGCG具有对抗肿瘤,调理内分泌和免疫系统,抗突变以及预防和治疗心脑血管疾病等作用。EGCG能够促进肿瘤细胞凋亡,减少肿瘤中HDAC1的表达,同时能够显著降低AD脑内与肿瘤中APP的含量,同时激活AD脑内A β的清除机制。本实验在预实验的基础上,以PC12细胞为模型着重研究EGCG诱导肿瘤细胞促凋亡的作用及表观遗传学机制,探讨APP与HDAC1之间的作用关系,以及EGCG对APP分解代谢途径的调控作用；同时我们通过检测人的肝癌及癌旁组织的中HDAC1和APP的表达辅助验证HDAC1与APP的相互关系。方法：无胸腺的裸鼠,在注射PC12细胞成瘤后,随机分成PBS组和EGCG组,从注射细胞到给药完成时间为23天。通过Tunel染色及Westernblot检测肿瘤抑制情况。体外实验我们将EGCG作用于PC12细胞上通过MTT及流式细胞术来检测细胞凋亡率,用Westernblot来检测APP, HDAC1, Casepase家族,Bc1-2, Bax的变化情况,分析EGCG促凋亡的机制,之后通过检测sAPP a, sAPP β, αa-scretase,β-secretase, r-secretase, AICD, Aβ的蛋白含量变化来说明EGCG对肿瘤内APP分解代谢途径的影响。应用免疫组化检测人的肝癌及癌旁组织中APP及HDAC1的表达。结果：1.EGCG能够抑制异位种植瘤的生长：腹腔注射EGCG组的裸鼠肿瘤明显小于PBS组的肿瘤,抑制率达53%(P0.01,n=8)。2.EGCG具有促凋亡作用：通过Tunel染色,我们发现EGCG的促凋亡作用明显高于PBS。同样,EGCG作用在PC12细胞上48h,72h后,经MTT检测发现细胞存活率呈梯度下降,且72h的存活率要低于48h。3. EGCG促凋亡机制通路：EGCG促进肿瘤凋亡可能与其下调Bcl-2、提高Bax的表达有关,同时我们还发现EGCG能够促进Casepase-3和Casepase-7的切割,降低HDAC1的表达,这也与肿瘤凋亡的机制密不可分。4. EGCG对APP分解代谢途径的影响：肿瘤组织与细胞中APP呈高表达状态,同时EGCG能够下调肿瘤细胞中sAPPα, sAPPβ, α-scretase,β-secretase, γ-secretase, Aβ的表达,但AICD的含量无明显变化,且高剂量有上调趋势。5.肝癌组织中APP, HDAC1的表达高于癌旁组织,但两者并未出现相关性,同时与肝癌分期的统计中也并未出现相关性。结论：EGCG能够抑制肿瘤的增殖,促进肿瘤细胞凋亡,调节细胞内APP分解代谢途径,降低APP mRNA的表达,下调APP的蛋白表达,同时EGCG被证明是HDAC1的抑制剂,通过调控HDAC1的表达,同时下调APP介导肿瘤细胞的凋亡。肝癌组织中APP与HDAC1的表达高于癌旁组织。
【关键词】：表观遗传学 肿瘤 阿尔茨海默病 凋亡 淀粉样前体蛋白 HDAC1 肝癌
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R394
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 引言10-12
• 第一章 文献研究12-20
• 第一节 表观遗传学的研究现状12-13
• 一、表观遗传学12
• 二、表观遗传学的内容12-13
• 第二节 表观遗传学与阿尔茨海默病13-15
• 一、阿尔茨海默病的研究现状13
• 二、AD的表观遗传学的机制13-14
• 三、AD的表观遗传学的治疗14-15
• 第三节 表观遗传学与肿瘤15-16
• 一、表观遗传学与肿瘤的研究现状15
• 二、肿瘤的表观遗传学与治疗15-16
• 第四节 凋亡相关基因16-18
• 一、Bc1-2家族16
• 二、Casepase家族16-18
• 第五节 表没食子儿茶素没食子酸酯的研究应用18
• 第六节 APP分解代谢途径18-20
• 第二章 体内实验20-33
• 第一节 实验材料与方法20-26
• 一、动物及标本来源20
• 二、细胞株20
• 三、主要试剂20
• 四、仪器及耗材20
• 五、动物建模及分组20-25
• 八、图像采集及分析25-26
• 第二节 EGCG对异位种植瘤的作用26-28
• 一、EGCG抑制异种植肾上腺嗜铬细胞瘤的生长26
• 二、EGCG对体内增殖、凋亡的影响26-27
• 三、讨论27-28
• 四、结论28
• 第三节 EGCG对肿瘤组织中HDAC1与APP表达的影响28-33
• 一、EGCG对体内乙酰化水平的影响28-29
• 二、EGCG对肿瘤组织中APP表达的影响29-31
• 三、讨论31-32
• 四、结论32-33
• 第三章 体外实验33-45
• 第一节 实验材料与方法33-37
• 一、细胞株33
• 二、主要药物及试剂33
• 三、主要仪器33
• 四、溶液配制33
• 五、不同药物浓度配制33
• 六、其他试剂配制33-34
• 七、PC12细胞复苏34
• 八、细胞处理34-35
• 九、蛋白质电泳35-37
• 十、封闭与抗体杂交37
• 十一、ECL化学发光及图像处理37
• 十二、Annexin V-FITC细胞凋亡的检测37
• 第二节 EGCG对PC12细胞凋亡的影响及机制37-41
• 一、EGCG对PC12细胞增殖凋亡的影响37-39
• 二、EGCG对PC12细胞内凋亡因子的影响39-40
• 三、讨论40-41
• 第三节 EGCG对PC12细胞内HDAC1,APP表达的影响41-45
• 一、EGCG对HDAC1和APP的影响41-42
• 二、EGCG作为HDAC1的抑制剂对APP的调控以及对肿瘤细胞凋亡的影响42-43
• 三、讨论43-44
• 四、结论44-45
• 第四章 EGCG对PC12细胞内APP分解代谢的影响45-55
• 第一节 实验材料与方法45-49
• 一、细胞株45
• 二、主要药物及试剂45
• 三、仪器及耗材45
• 四、细胞培养溶液配制45
• 五、不同药物浓度配制45
• 六、细胞处理及蛋白浓度测定45-46
• 七、蛋白质电泳、转膜46
• 八、封闭及抗体杂交46
• 九、丙酮浓缩上清蛋白法46
• 十、PCR检测APP mRNA水平的变化46-48
• 十一、PC12细胞总RNA的提取48-49
• 第二节 EGCG对PC12细胞内APP分解代谢途径的影响49-55
• 一、不同剂量EGCG对PC12细胞内APP的影响49-50
• 二、不同剂量的EGCG对APP分解代谢酶的影响50-53
• 三、讨论53-54
• 四、结论54-55
• 第五章 肝癌组织及癌旁组织中APP与HDAC1的表达55-62
• 第一节 实验材料及方法55-56
• 一、标本来源55
• 二、主要试剂55
• 三、标本处理55
• 四、图片采集及处理55-56
• 五、结果统计56
• 第二节 肝癌组织中APP与HDAC1的表达及相关性分析56-62
• 一、患者的基本信息56
• 二、肝癌组织与癌旁组织中APP与HDAC1的表达56-59
• 三、APP、HDAC1、肝癌分期之间的关系59
• 四、在肝癌及癌旁组织中特殊表达的标本59-61
• 五、讨论61
• 六、结论61-62
• 结语62-63
• 参考文献63-69
• 附录69-70
• 研究生期间发表论文情况70-71
• 致谢71-72
• 统计学审核证明72

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本文编号：590217