细粒棘球蚴MAPKK样激酶及其下游成员ERK和P38酵母双杂交载体的构建与自激活鉴定

发布时间：2017-08-07 00:23

  本文关键词：细粒棘球蚴MAPKK样激酶及其下游成员ERK和P38酵母双杂交载体的构建与自激活鉴定

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【摘要】：目的构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)丝裂原活化蛋白激酶激酶(EgMKK1)及其下游成员ERK、P38酵母双杂交载体,并检测融合蛋白对酵母菌生长的毒性作用及自激活活性。方法采集绵羊肝脏感染的Eg原头蚴,生理盐水冲洗5次,TRIzol法提取原头蚴总RNA,取1μg RNA反转录cDNA。以cDNA为模板,PCR分别扩增EgMKK1、EgERK和EgP38基因片段,分别经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、EcoRⅠ和BamHⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,酶切片段连接至酵母双杂交载体pGADT7或pGBKT7,经酶切及测序鉴定正确后,应用PEG/LiAc法将重组载体转化入感受态酵母菌株Y2HGold,利用固体培养基筛选,检测融合蛋白对酵母菌株生长的毒性作用及自激活活性。结果经PCR扩增,分别获得目的基因EgMKK1、EgERK和EgP38。构建的重组酵母双杂交载体pGADT7-EgMKK1、pGBKT7-EgERK及pGBKT7-EgP38经双酶切,分别得到1 017bp、1 086bp和1 107bp目的基因片段,大小与预测值相符。重组酵母双杂交载体转化Y2HGold酵母菌在SD/-Trp平板上形成直径为1.5~2.0mm的菌落,与原始载体pGADT7或pGBKT7转化酵母菌菌落大小一致;重组酵母双杂交载体转化酵母菌在SD/-Trp和SD/-Leu平板均有直径约2mm白色菌落生长,而SDO/X/A和DDO/X/A固体培养基平板上无蓝色菌落生长。结论成功构建了酵母双杂交载体pGADT7-EgMKK1、pGBKT7-EgERK和pGBKT7-EgP38,其表达蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性和自激活作用,为进一步研究EgMKK1与其下游成员EgERK、EgP38之间的相互作用奠定了基础。
【作者单位】： 新疆医科大学第一附属医院 新疆重大疾病医学重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地 新疆包虫病基础医学重点实验室;
【关键词】： 细粒棘球绦虫 MAPK 酵母双杂交 毒性 自激活
【基金】：国家自然科学基金项目(No.81101271,81260252) 长江学者和创新团队发展计划项目(No.IRT1181) 新疆医学动物模型研究重点实验室开放课题(No.XJDX1103-2012-03)
【分类号】：R392
【正文快照】： 包虫病(hidatidosis)是由棘球绦虫的幼虫寄生于人体及某些动物体内所致的一种严重的人畜共患寄生虫疾病[1]。该病成全球性分布,欧洲及南美洲等包虫病多发地区主要以多房棘球蚴感染所致的泡型包虫病多见,我国主要以细粒棘球蚴感染所致的囊型包虫病多见,约占我国包虫病人的97%[2

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本文编号：632122