RNA-Seq揭示轮状病毒感染引起的固有免疫研究

发布时间：2017-08-12 23:03

  本文关键词：RNA-Seq揭示轮状病毒感染引起的固有免疫研究

  更多相关文章： 轮状病毒感染 肠上皮细胞 固有免疫 转录组测序 IFNλ1表达 信号通路

【摘要】：为了揭示轮状病毒在感染过程中宿主与其相互作用的相关基因,本研究使用实验室自主分离的轮状病毒CC0812-1毒株感染肠上皮细胞系HT29,病毒使用滴度1TCID50/cell,感染后12h提取HT29细胞总RNA用Illumina HiSeq 2500进行转录组测序。将其与未感染的HT29细胞转录组进行比较筛选得到473个差异表达基因,病毒感染的HT29细胞中418个基因表达量上调,55个基因表达量下调。通过KEGG分析,有82个差异表达基因注释到12条免疫相关的信号通路中,其中大部分差异表达基因广泛参与到病原相关分子模式识别、补体系统调节、细胞因子反应、细胞凋亡等抗病毒反应相关的信号传导途径中,为验证RNA-Seq技术开展病毒感染后转录组研究的可靠性,我们随机选取7个差异表达基因以qRT-PCR方法进行检验,结果显示这些基因的变化趋势与RNA-Seq具有一致性,证明RNA-Seq技术是筛选差异表达基因的一种可行方法。通过RNA-Seq筛选得到的473个差异表达基因为轮状病毒与宿主相互作用以及轮状病毒引起的固有免疫反应研究提供了潜在靶基因。本研究为探究轮状病毒上调IFN λ1 mRNA表达的机制,使用滴度为1TCID50/cell的轮状病毒CC0812-1株分别感染肠上皮细胞系HT29和HCT116,感染后6h、12h、24h提取细胞总RNA,通过qRT-PCR检测IFN λ1 mRNA的表达水平,结果显示轮状病毒引起的IFN λ1 mRNA表达上调具有时间依赖性,感染后6hIFN λ1 mRNA表达开始上调(HT29上调11.54倍,HCT1164.96倍),感染后12 h IFN λ1 mRNA上调表达最高(HT29上调82.56倍,HCT11643.41倍),感染后24 h IFN λ1 mRNA上调表达又有所降低(HT29上调66.76倍,HCT11622.83倍)。使用不同滴度(0.01 TCID50/cell、0.1 TCID50/cell、1TCID50/cell的轮状病毒CC0812-1株分别感染肠上皮细胞系HT29和HCT116,感染后12h提取细胞总RNA,通过qRT-PCR检测IFN λ1 mRNA的表达水平,结果显示轮状病毒引起的IFN λ1 mRNA上调表达具有病毒滴度依赖性,随着病毒感染滴度的增加,IFN λ1 mRNA上调表达水平亦逐渐增加,滴度为0.01 TCID50/cell病毒诱导HT29和HCT116细胞中IFN λ1 mRNA分别上调表达2.03倍和2.02倍,滴度为0.1 TCID50/cell病毒诱导HT29和HCT116细胞中IFN λ1 mRNA分别上调表达10.29倍和11.59倍,滴度为1 TCID50/cell病毒诱导HT29和HCT116细胞中IFN λ1 mRNA分别上调表达82.56倍和43.41倍。与此同时,选择滴度为1TCID50/cell的轮状病毒感染12 h后,qRT-PCR检测显示细胞内识别外源dsRNA的模式识别受体RIG-I与MDA5和几种重要的IRF(IRF1、 IRF3、IRF7、IRF9)均显著上调表达,感染的HT29细胞中RIG-I、MDA5、IRF1、 IRF3、IRF7、IRF9 mRNA分别上调表达5.3、5.67、4.96、1.72、3.61和1.50倍,感染的HCT116细胞中RIG-I、MDA5、IRF1、IRF3、IRF7、IRF9 mRNA分别上调表达2.35、2.20、2.32、1.49、2.52和1.64倍。通过RIG-I siRNA、MDA5 siRNA单独干扰的HCT116细胞、RIG-I siRNA和MDA5 siRNA同时干扰的HCT116细胞与正常组细胞感染病毒12h后相比其IFN λ1 mRNA表达依次为后者的0.37、0.73与0.27倍。结果表明干扰HCT116细胞内RIG-I与MDA5后轮状病毒感染诱导的IFN λ1 mRNA上调表达受到抑制,由此我们初步推断,宿主细胞主要通过RIG-I/MDA5识别轮状病毒感染,且激活下游信号通路引起IFN λ1表达。
【关键词】：轮状病毒感染 肠上皮细胞 固有免疫 转录组测序 IFNλ1表达 信号通路
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第1章 文章综述13-26
• 1.1 轮状病毒简述13-19
• 1.1.1 发现13
• 1.1.2 轮状病毒分类与结构13-14
• 1.1.3 轮状病毒复制周期14-16
• 1.1.4 轮状病毒传播途径与致病机制16-17
• 1.1.5 轮状病毒免疫17-19
• 1.2 高通量转录组测序19-25
• 1.2.1 转录组学概述19-20
• 1.2.2 第二代测序技术20-24
• 1.2.3 RNA-Seq在病毒与宿主相互作用研究中的应用24-25
• 1.3 本课题研究思路25-26
• 第2章 转录组测序揭示抗轮状病毒相关免疫基因26-56
• 2.1 实验材料26-28
• 2.1.1 细胞系26
• 2.1.2 病毒株26
• 2.1.3 主要试剂26
• 2.1.4 细胞培养液26-27
• 2.1.5 主要仪器与耗材27-28
• 2.2 实验方法28-35
• 2.2.1 细胞培养、冻存与复苏28
• 2.2.2 轮状病毒增殖28-29
• 2.2.3 轮状病毒滴度测定29-30
• 2.2.4 轮状病毒感染HT29细胞30
• 2.2.5 细胞总RNA提取30
• 2.2.6 细胞总RNA质量检测30-31
• 2.2.7 测序文库构建31
• 2.2.8 文库质控与测序31
• 2.2.9 测序数据处理31-32
• 2.2.10 与参考基因组比对分析32-33
• 2.2.11 实时荧光定量PCR鉴定RNA-Seq的准确性33-35
• 2.3 实验结果35-52
• 2.3.1 轮状病毒细胞病变效应35-36
• 2.3.2 病毒效价36-37
• 2.3.3 细胞总RNA提取37
• 2.3.4 细胞总RNA样品质量检测37-38
• 2.3.5 测序数据及质量分析38-39
• 2.3.6 对统计39
• 2.3.7 转录组文库质量评估39-41
• 2.3.8 基因表达定量分析41-43
• 2.3.9 基因差异表达分析43-47
• 2.3.10 免疫相关基因差异表达47-51
• 2.3.11 荧光定量PCR验证转录组测序结果51-52
• 2.4 讨论52-56
• 2.4.1 RNA-seq数据质量与可靠性52-53
• 2.4.2 轮状病毒感染前后宿主细胞转录组变化讨论53-56
• 第3章 RV诱导肠上皮细胞产生IFNλ1的机制初步探究56-65
• 3.1 实验材料56
• 3.1.1 细胞系56
• 3.1.2 病毒株56
• 3.1.3 主要试剂56
• 3.1.4 主要仪器设备56
• 3.2 实验方法56-58
• 3.2.1 轮状病毒感染HT29与HCT116细胞系56-57
• 3.2.2 siRNA转染HCT116细胞57
• 3.2.3 RNA提取、cDNA合成及qRT-PCR检测mRNA表达水平57
• 3.2.4 数据统计分析57-58
• 3.3 实验结果58-62
• 3.3.1 RV诱导肠上皮细胞IFNλ1上调表达58-59
• 3.3.2 RV诱导肠上皮细胞dsRNA受体RIG-I/MDA 5 mRNA上调表达59-60
• 3.3.3 RV诱导肠上皮细胞IRF mRNA上调表达60-61
• 3.3.4 RIG-I/MDA5信号通路激活IFNλ1表达61-62
• 3.4 讨论62-65
• 参考文献65-72
• 英文缩写表72-73
• 硕士期间发表的论文73-74
• 致谢74

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