胞红蛋白在氧化低密度脂蛋白诱导内皮细胞损伤中的作用及机制

发布时间：2017-08-17 08:13

  本文关键词：胞红蛋白在氧化低密度脂蛋白诱导内皮细胞损伤中的作用及机制

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【摘要】：[目的]胞红蛋白(cytoglobin,CYGB)是一种具有抗氧化应激作用的珠蛋白,研究显示CYGB能够通过抗氧化应激来达到细胞保护作用。本文旨在探讨人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)在氧化损伤过程中CYGB的表达;构建CYGB表达/干扰质粒HUVECs模型,研究CYGB在氧化应激过程中对HUVECs的保护作用并探讨可能的机制。[方法]1、培养HUVECs,倒置显微镜下观察细胞形态。2、实验分为4组:对照组,25μg/ml oxLDL、50μg/ml oxLDL、100μg/ml oxLDL、200μg/ml oxLDL处理组;Western blot检测HUVECs在不同浓度oxLDL刺激24h后,细胞内CYGB蛋白的表达水平;Western blot检测HUVECs在100μg/ml oxLDL刺激不同时间(4、8、12、24h)后,细胞内CYGB蛋白的表达水平。3、将HUVECs分为4组:对照组、100μg/ml oxLDL组、100μg/ml oxLDL+CYGB组及100μg/ml oxLDL+CYGB sh RNA组,然后观察在氧化应激时CYGB对HUVECs的作用。于24h后,检测CYGB蛋白水平、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-PX)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、乳酸脱氢酶(Lactic Dehydrogenase,LDH)的活性以及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量,以及Bcl2和Bax的蛋白水平;4、将HUVECs分为3组:对照组、100μg/ml oxLDL组、100μg/ml oxLDL+Staurosporine(PKC抑制剂)组。观察PKC抑制剂在oxLDL诱导HUVECs损伤中的作用。检测CYGB蛋白水平、GSH-PX、SOD、LDH、MDA、Bcl2和Bax的蛋白水平。[结果]1、倒置显微镜下显示,正常HUVECs呈现典型铺路石状态。2、Western blot结果显示:0,25μg/ml oxLDL、50μg/ml oxLDL、100μg/ml oxLDL处理HUVECs 24h后,CYGB表达水平高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);100μg/ml oxLDL处理HUVECs 4、8、12、24h后,CYGB表达水平高于对照组,在24h组CYGB表达水平最高,差异有统计学意义(P0.05)。3、转染CYGB表达质粒后HUVECs中CYGB的表达明显增加;转染CYGB干扰质粒后HUVECs中CYGB的表达明显降低。4、Western blot结果显示:100μg/ml oxLDL组和100μg/ml oxLDL+CYGB组中CYGB蛋白表达水平均高于正常对照组,而100μg/ml oxLDL+CYGB shRNA组中CYGB蛋白表达水平则低于正常对照组,差异有统计学意义(P0.05)。与100μg/ml oxLDL组相比,100μg/ml oxLDL+CYGB组中细胞SOD、GSH-PX活性显著提高,Bcl2的表达也显著增加(P0.05),LDH的活性和MDA的含量明显降低,Bax的表达明显降低(P0.05);与100μg/ml oxLDL组相比,100μg/ml oxLDL+CYGB sh RNA组中细胞SOD、GSH-PX活性显著降低,Bcl2的表达降低(P0.05),LDH的活性和MDA的含量明显升高,Bax的表达增加(P0.05)。5、Western blot结果显示:与正常对照组相比,100μg/ml oxLDL组CYGB表达升高;而与100μg/ml oxLDL组相比,100μg/ml oxLDL+Staurosporine组中CYGB蛋白表达水平降低(P0.05);与100μg/ml oxLDL组相比,100μg/ml oxLDL+Staurosporine组中细胞SOD、GSH-PX明显降低,Bcl2的表达也显著降低(P0.05),LDH的活性和MDA的含量明显升高,Bax的表达明显增加(P0.05)。[结论]1、CYGB在oxLDL引起的内皮细胞损伤中能发挥拮抗作用;2、CYGB发挥拮抗作用可能与PKC信号通路有关。
【关键词】：人脐静脉内皮细胞 氧化应激 胞红蛋白 蛋白激酶C
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-15
• 第1章 绪论15-19
• 1.1 引言15-17
• 1.2 技术路线17-19
• 1.2.1 HUVECs形态观察17
• 1.2.2 构建HUVECs的氧化损伤模型17
• 1.2.3 CYGB对oxLDL处理的HUVECs的保护作用17-18
• 1.2.4 CYGB对oxLDL处理的HUVECs保护作用的初步机制18-19
• 第2章 实验材料19-21
• 2.1 细胞株19
• 2.2 主要试剂19-20
• 2.3 主要仪器20
• 2.4 数据分析20-21
• 第3章 实验方法21-31
• 3.1 细胞培养21-22
• 3.1.1 细胞复苏21
• 3.1.2 细胞传代21
• 3.1.3 细胞冻存21-22
• 3.2 实验分组22-23
• 3.3 oxLDL处理HUVECs对CYGB表达的影响23-26
• 3.3.1 不同浓度的oxLDL处理HUVECs对CYGB表达的影响23-25
• 3.3.1.1 试剂配制23-24
• 3.3.1.2 蛋白提取24
• 3.3.1.3 蛋白定量24
• 3.3.1.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）24-25
• 3.3.2 oxLDL处理HUVECs不同时间对CYGB表达的影响25-26
• 3.4 CYGB表达/干扰HUVECs模型的构建和鉴定26
• 3.5 GSH-PX活性测定26-28
• 3.5.1 试剂组成及配制26-27
• 3.5.2 样本处理27
• 3.5.3 GSH-PX活性测定操作步骤27-28
• 3.6 SOD活性检测28-29
• 3.6.1 试剂组成及配制28
• 3.6.2 样本处理28
• 3.6.3 SOD活性检测步骤28-29
• 3.7 LDH活性检测29-30
• 3.7.1 试剂组成及配制29
• 3.7.2 样本处理29
• 3.7.3 LDH活性检测步骤29-30
• 3.8 MDA含量检测30-31
• 3.8.1 试剂组成及配制30
• 3.8.2 样品处理30
• 3.8.3 MDA含量检测步骤30-31
• 第4章 实验结果31-47
• 4.1 细胞形态学观察结果31
• 4.2 oxLDL处理HUVECs对CYGB表达的影响31-33
• 4.2.1 不同浓度oxLDL处理HUVECs对CYGB表达的影响31-32
• 4.2.2 oxLDL处理HUVECs不同时间对CYGB表达的影响32-33
• 4.3 CYGB对oxLDL处理的HUVECs的拮抗作用33-40
• 4.3.1 CYGB表达/干扰HUVECs的构建和鉴定33-34
• 4.3.2 oxLDL处理HUVECs对CYGB蛋白表达的影响34-35
• 4.3.3 CYGB对oxLDL处理HUVECs时GSH-PX、SOD、LDH活性及MDA含量的影响35-38
• 4.3.4 CYGB对oxLDL处理HUVECs时Bcl2、Bax蛋白表达的影响38-40
• 4.4 PKC抑制剂对HUVECs CYGB蛋白表达的影响40-41
• 4.4.1 PKC抑制剂的抑制效果40
• 4.4.2 PKC抑制剂对oxLDL处理的HUVECs中CYGB蛋白表达的影响40-41
• 4.5 CYGB对oxLDL处理的HUVECs的拮抗作用的初步机制41-47
• 4.5.1 PKC抑制剂对oxLDL处理的HUVECs中SOD、GSH-PX、LDH活性及MDA含量的影响41-44
• 4.5.2 PKC抑制剂对oxLDL处理的HUVECs中Bcl2、Bax蛋白表达的影响44-47
• 第5章 讨论47-51
• 第6章 结论51-53
• 参考文献53-57
• 综述 新型缺氧保护因子胞红蛋白的研究进展57-69
• 参考文献64-69
• 攻读学位期间的科研成果69-70
• 课题资助情况70-71
• 致谢71-72

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