生物反应器（VERO细胞）培养森脑病毒工艺的摸索

发布时间：2017-08-21 19:02

  本文关键词：生物反应器（VERO细胞）培养森脑病毒工艺的摸索

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【摘要】：目的利用篮式生物反应器进行vero细胞、森林脑炎病毒的高密度培养,探索森林脑炎病毒灭活疫苗制备工艺。森林脑炎病毒液经超滤浓缩、β-丙内酯灭活、柱层析纯化,为生物反应器制备森林脑炎病毒灭活疫苗的生产工艺和生物反应器大规模培养工艺积累经验。方法使用5L、14L篮式生物反应器配合片状载体培养vero细胞,在细胞培养阶段,检测平台期细胞密度,并从生物反应器接种细胞量、灌流速度、培养液等方面优化vero细胞的培养条件。病毒培养阶段,检测病毒滴度变化,并通过病毒感染复数、维持液小牛血清浓度、培养基灌流速度等方面优化病毒培养条件,从而提高病毒收获液病毒滴度,并使病毒收获维持较长的时间。在整个生物反应器培养过程中,检测培养液中PH、DO葡萄糖浓度、乳酸浓度、渗透压的变化,通过这一系列的指标来确定生物反应器细胞培养和病毒培养的参数。收获的病毒液超滤浓缩、灭活后,经Sepharose 4FF柱层析纯化得到疫苗原液,按照《中国药典》三部(2010版)进行相关检测。结果经反复试验,得到比较适合生物反应器大规模培养条件为:细胞培养阶段PH为7.2,DO为50~60%,vero细胞的最佳接种量为5~7.5×105cell/ml;病毒培养阶段PH为7.4,DO为45~55%,病毒的最佳感染复数为0.1~0.04。细胞到达平台期时最高细胞密度可达到1.04×107cell/ml;病毒感染后,约3天左右病毒滴度可以达到8.0 log LD50/m L,每日病毒收获约一个罐体积,收获时间可达30~35天,平均病毒滴度为8.4 log LD50/m L。将森脑病毒液通过截留分子量为300KD的Millipore膜包进行超滤浓缩,按0.025%(体积比为1:4000)加入β-丙内酯在4℃灭活48小时可灭活完全。经Sepharose 4FF柱层析纯化后得到疫苗原液,其杂蛋白去除率高达87.7%,其中抗原含量、小牛血清白蛋白、vero细胞宿主蛋白的残留量均符合药典规定。结论利用生物反应器进行Vero细胞培养制备森林脑炎病毒,条件易于控制,能大量节约劳动成本,有效减少污染的机率,能得到较高的细胞密度并获得高毒力的病毒收获液,为生物反应器制备vero细胞森林脑炎病毒灭活疫苗生产工艺奠定了基础。
【关键词】：Vero细胞 森林脑炎病毒 生物反应器 片状载体
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373.31
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 前言11-18
• 1 森林脑炎病毒的生物学特性11-12
• 2 森林脑炎的流行病学特征12-13
• 3 森林脑炎的诊断、预防及治疗13-15
• 3.1 森林脑炎的诊断13-14
• 3.2 森林脑炎的预防和治疗14-15
• 4 森林脑炎疫苗的研究现状15-16
• 5 细胞生物反应器的发展及种类16-17
• 6 微载体培养技术17-18
• 材料与仪器18-22
• 1 材料18-20
• 1.1 细胞18
• 1.2 毒种18
• 1.3 主要试剂18
• 1.4 实验动物18
• 1.5 常用溶液配制18-20
• 2 仪器20-22
• 方法22-32
• 1 生物反应器参数调节及灭菌22-23
• 1.1 pH电极的校正22
• 1.2 溶氧电极校正22
• 1.3 搅拌速度22
• 1.4 温度22
• 1.5 pH值22
• 1.6 溶氧22-23
• 1.7 生物反应器高压灭菌23
• 3 细胞培养23-24
• 3.1 vero细胞的复苏23
• 3.2 细胞传代培养23-24
• 4 片状载体细胞计数24
• 4.1 结晶紫染色计数法24
• 4.2 胰酶消化计数法24
• 5 细胞接种24
• 6 病毒培养24-25
• 6.1 病毒接种及培养24-25
• 6.2 MOI计算25
• 7 原液制备25
• 7.1 超滤浓缩25
• 7.2 病毒的灭活25
• 7.3 柱层析纯化25
• 8 检测25-32
• 8.1 葡萄糖浓度测定25-26
• 8.2 乳酸浓度测定26
• 8.3 培养液渗透压检测26-27
• 8.4 病毒滴度检测27
• 8.5 病毒灭活安全试验27
• 8.6 抗原含量检测27-28
• 8.7 小牛血清残留量检测28-29
• 8.8 Vero细胞宿主蛋白检测29
• 8.9 Lowry法检测蛋白含量检测29-30
• 8.10 DNA残留量检测30-32
• 结果32-39
• 1 片状载体细胞计数32-33
• 1.1 两种不同细胞计数法的比较32
• 1.2 不同细胞接种浓度对平台期细胞密度的影响32-33
• 2 培养基中葡萄糖、乳酸浓度分析33-34
• 3 渗透压的影响34
• 4 不同细胞接种浓度对病毒滴度的影响34-36
• 5 MOI（感染复数）对病毒增殖的影响36-37
• 6 不同小牛血清浓度对病毒滴度的影响37-38
• 7 四批样品检定结果38-39
• 结论39-40
• 讨论40-43
• 1 片状载体的细胞计数的方法40
• 2 葡萄糖、乳酸、渗透压的影响40-41
• 3 细胞密度、感染复数对病毒产量的影响41-43
• 参考文献43-47
• 致谢47

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 赵俊伟;王环宇;王英;;中国蜱传病原体分布研究概况[J];中国媒介生物学及控制杂志;2012年05期

2 宋宗明;刘雁波;黄永成;;森林脑炎疫苗的研究进展[J];微生物学免疫学进展;2005年04期

3 董关木,宋宗明,刘文雪,安祺,王晓理,王显军,韩亮,涛波,孔艳,杨立宏;森林脑炎纯化疫苗接种反应和免疫学效果观察[J];中国生物制品学杂志;2005年06期

4 毕维铭,邓厚培,卜笑妍;森林脑炎自然疫源地区划研究[J];首都师范大学学报(自然科学版);1997年02期

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1 吴浩飞;狂犬病疫苗残余DNA去除方法研究[D];湖北大学;2012年

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本文编号：714565