靶向Group2流感病毒血凝素茎部的广谱反应性抗体筛选与研究

发布时间：2017-08-22 00:17

  本文关键词：靶向Group2流感病毒血凝素茎部的广谱反应性抗体筛选与研究

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【摘要】：流感病毒是抗原性高度变异的病毒,尤其是甲型流感病毒,具有更广泛的宿主及高度变异性,根据病毒血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(neuraminidase, NA),甲型流感病毒分为18个HA亚型(H1-H18)和11个NA亚型(N1-N11),18个HA亚型包括两个组(Group),即Group1 (H1、H2、 H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18)和Group2 (H3、H4、 H7、H10、H14和H15)。HA是病毒表面主要抗原,由高度变异的头部和相对保守的茎部[Cys52-Cys277 (H3序号)]组成。目前预防流感病毒的主要措施是疫苗接种,疫苗组份包括甲型流感病毒(H1N1和H3N2亚型)和一个或两个乙型流感病毒株,疫苗主要诱导机体产生针对HA头部的抗体应答,但HA头部易发生变异导致病毒抗原漂移,造成疫苗株与流行株抗原不匹配。而疫苗接种不易诱导机体产生靶向HA茎部的抗体。近年来,通过杂交瘤、噬菌体展示、B细胞克隆技术陆续从人和小鼠分离到对多个流感病毒亚型有广谱中和活性的单克隆抗体,大多数抗体(如6F12、CR6261、F10、C179、KB2、GG3、2D1等)靶向Group 1 HA,而靶向Group2HA的广谱中和抗体(CR8020、CR8043、VIS410)及靶向Group1/2HA的单抗(FI6、CR9114、CT149)为数不多,该类抗体有效结合浓度在1-40μg/ml,其中部分抗体不能有效中和H7或H10亚型毒株。抗体除通过Fab结合病毒抗原发挥中和活性,在体内抗体也可通过Fc介导抗体依赖性细胞毒效应(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)或补体依赖细胞毒效应(complement dependent cytotoxicity, CDC)来杀伤病毒感染的靶细胞。如CR9114抗体在体外不能中和乙型流感病毒,但在体内能通过ADCC保护小鼠免受病毒攻击。本课题旨在对季节性流感疫苗人群筛选靶向Group2流感病毒血凝素茎部的广谱反应性抗体。实验流程为：1.制备杆状病毒表达系统表达嵌合cH7/3HA(由A/Netherlands/219/03(H7N7)亚型流感HA头部和A/Aichi/2/1968(H3N2)亚型HA茎部组成)和ZJH7 (A/Zhejiang/1/2013(H7N9))抗原。2.用cH7/3HA对49名在2009年接种季节性流感疫苗(A/Brisbane/59/2007(Bris59), A/Brisbane/I 0/2007和B/Brisbane/60/2008)免前0天、免后21天配对血清进行检测,与cH7/3结合阳性血清再经ZJH7结合ELISA验证；测定阳性血清中ZJH7结合抗体的亲和指数(AI)；用生物素标记的FI6-370(识别Group 1/2 HA茎部)、F10(识别Group 1 HA茎部)抗体进行竞争ELISA检测；以血凝抑制(HI)实验明确阳性血清识别的抗原区域。3.体外培养免后21天外周血记忆性B细胞(CD19+CD27+),取第10天培养细胞上清,用ZJH7抗原检测,并对阳性孔进行IgG定量,重链、轻链分型,通过RT-PCR方法建立重链、轻链基因文库,组合转染筛选候选抗体基因,检测筛选出的阳性抗体与Group2 HA(H3、7、10)抗原和Group1 HA(H1、5、9)抗原的结合活性；并检测阳性单克隆抗体HI及ADCC效应。结果如下：1.重组蛋白cH7/3、ZJH7HAs可在昆虫细胞中分泌表达,片段大小约为70kD,纯化的cH7/3、ZJH7HAs蛋白以三聚体形式存在,有血凝活性和抗原反应性。2.49名季节性疫苗接种者中,有六对(编号分别为048、049、057、095、139和152)血清在免后21天对cH7/3结合明显增加；再以ZJH7抗原检测这六对血清,只有152血清抗体免后21天与ZJH7结合的抗体滴度比免前高2.1倍以上,具有高亲和指数(AI0.5),识别FI6-370及F10相似的HA表位、无HI活性。3.39孔152样本的外周血记忆性B细胞培养上清对ZJH7抗原结合,最后选择B细胞状态好,重链、轻链分型检测OD值0.3以上共9孔进行抗体基因克隆,建立mVH, mVL抗体库。筛选出单克隆抗体H3-2/κ3-1能结合Group1 HA(H1、5、9)和Group2 HA(H3、7、10)抗原,最低有效结合浓度在30-7.0μg/ml;该抗体重链可变区为VH1-69*01编码,HCDR3含19个氨基酸,与胚系基因相比VH有12个突变氨基酸位点；轻链由VK3-20*O1编码,LCDR3含9个氨基酸,与胚系基因高度同源。H3-2/κ3-1抗体对Group 1病毒[Bris59HlNl和RGH5N6(含A/Guangdong/1/2014(H5N6) HA NA抗原)]和Group2病毒[RG ZJH7N9和RGH10N8含A/Jiangxi/346/2013(H10N8) HA^ NA抗原)均无HI反应活性。H3-2/κ3-1抗体具有ADCC活性。结论：在季节性流感疫苗接种个体能检测到靶向HA茎部的广谱反应性抗体,检出率为2%(1/49),成功获得了一株能广泛结合Group 1/2 HA的单克隆抗体,最低结合浓度为3.0-7.0μg/ml,具有ADCC效应。
【关键词】：流感病毒 杆状病毒表达系统 Group2血凝素茎部抗体 B细胞 ADCC
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373
【目录】：

• 缩略词表6-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 前言14-17
• 第一节 流感病毒血凝素在昆虫杆状病毒系统中的表达和生物活性鉴定17-38
• 1 材料与方法17-33
• 1.1 试剂与耗材17-21
• 1.2 方法步骤21-33
• (一) cH7/3、ZJH7基因构建21-24
• (二) Bacmid-cH7/3HA、Bacmid-ZJH7构建24-27
• (三) Bacmid-cH7/3、Bacmid-ZJH7转染昆虫sf9细胞27-28
• (四) Bacmid-cH7/3、Bacmid-ZJH7重组蛋白的表达与纯化28-29
• (五) cH7/3蛋白和ZJH7蛋白活性的鉴定29-33
• 2 结果及结论33-36
• 3 讨论36-38
• 第二节 季节性流感疫苗免疫人群血清中Group2 HA茎部广谱反应性抗体水平的检测38-53
• 1 材料和方法39-46
• 1.1 材料39-40
• 1.2 方法40-46
• (一) 间接酶联免疫吸附实验筛选Group2 HA茎部广谱反应性抗体40-41
• (二) 血清抗体亲和指数(AI)的测定41-42
• (三) 检测六对血清是否含有与FI6-370和F10抗体相似的抗原结合表位42-46
• 2 结果及结论46-51
• 3 讨论51-53
• 第三节 B细胞培养、抗体重链、轻链基因克隆及筛选Group2 HA茎部广谱反应性抗体53-79
• 1 材料和方法53
• 1.1 材料53-54
• 1.2 方法54-69
• (一) 记忆性B细胞培养54-55
• (二) B细胞培养上清中的阳性抗体筛选55-56
• (三) 抗体可变区基因的扩增,筛选和分析56-64
• (四) 抗体大量表达,纯化及鉴定64-69
• 2 结果及结论69-77
• 3 讨论77-79
• 结论与展望79-80
• 参考文献80-88
• 综述88-106
• 参考文献99-106
• 致谢106-108
• 攻读硕士期间发表的论文108-109
• 附录 已发表论文全文109-115

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本文编号：715970