PCT单克隆抗体的制备及其ELISA检测方法的初步建立

发布时间：2017-08-23 09:08

  本文关键词：PCT单克隆抗体的制备及其ELISA检测方法的初步建立

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【摘要】：目的:降钙素原(PCT)是一种在感染的情况下由细菌、寄生虫和真菌感染等感染诱导刺激产生释放的一种蛋白质。在健康状态下,PCT的含量处于较低的水平(0.1 ng/mL),但是在细菌感染、脓毒症、败血症等情况下PCT水平显著升高(2 ng/mL)。目前PCT检测在临床中得到了广泛应用,相关检测方法和产品不断涌现。但PCT检测试剂的核心成分-PCT抗体国内一直未解决,国内PCT酶联免疫检测方法的研究尚处于起步阶段。制备可用于临床的单克隆抗体和建立PCT酶联免疫检测方法是目前研究的热点。本实验旨在利用单克隆抗体制备技术,制备符合临床使用要求的PCT单克隆抗体,并用其建立PCT酶联免疫定量检测方法,为临床判别细菌性感染疾病和抗生素合理应用提供一种有效的方法和应用指导。方法:用his-hrPCT抗原作为免疫原免疫BaLb/c小鼠,间接ELISA法检测免疫效价。采用免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合制备杂交瘤细胞,利用trx-hrPCT蛋白作为包被抗体,HRP-抗鼠IgG作为酶标抗体,通过间接ELISA法筛选阳性细胞株,并通过有限稀释法筛选、获得稳定的单克隆抗体细胞株,从而制备单克隆抗体。采用双抗体夹心法筛选获得配对的PCT单抗,通过对其包被液及包被条件选择、封闭液及封闭条件选择、最佳包被抗体浓度和酶标抗体浓度确定、最佳反应时间、线性范围、批内精密性、回收率、稳定性、灵敏度及特异性、干扰因素、临床标本检测等研究,建立PCT酶联免疫双抗体夹心法的检测方法。结果:当小鼠免疫效价达到1:105后,以脾细胞与骨髓瘤细胞进行3次细胞融合,筛选得到10株阳性细胞株,通过有限稀释法3次克隆化最终获得4株阳性细胞株,分别命名为F1D5,F2H3,F3B7,F3D2。注射腹腔制备腹水,间接ELISA检测效价均达到3.2×105,以辛酸-硫酸铵法纯化抗体。标记抗体,获得一组(F1D5、F3B7)配对单抗,并以此为基础研究确定PCT双抗体夹心ELISA检测的相关条件:包被液及包被条件为0.05 mol/L、pH 9.6的CB缓冲液4℃包被12 h;封闭液及封闭条件为0.6%BSA 37℃封闭2 h;最佳包被抗体F1D5浓度为400 ng/mL,酶标抗体F3B7浓度为1:8000;37℃孵育30 min,酶标二抗孵育30 min,显色20 min的反应模式。建立的检测方法线性范围为0.5 ng/mL-10ng/mL(R2=0.9912);批内精密性小于10%;高中低值平均回收率分别为99.00%、98.68%、108.69%;稳定性检测显示:37℃可稳定保存9天;灵敏度为95.6%,特异性为97.8%;PCT阴性及阳性干扰物质对本实验结果无明显干扰;与罗氏检测试剂盒对比检测200份临床血清,显示相关性良好(R2=0.9391)。结论:获得一组配对的PCT单克隆抗体,并初步建立了双抗体夹心ELISA检测PCT的定量检测方法。
【关键词】：PCT 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA方法 细菌感染
【学位授予单位】：河南工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 绪论12-22
• 1.1 降钙素原概述12-13
• 1.1.1 降钙素原来源12
• 1.1.2 降钙素原生物学功能12-13
• 1.2 降钙素原检测的临床意义13-16
• 1.2.1 败血症的辅助诊断、疗效监测13-14
• 1.2.2 脓毒症的辅助诊断、疗效监测14
• 1.2.3 细菌性和非细菌性炎症鉴别14-15
• 1.2.4 其他相关疾病的辅助诊断、疗效评估15-16
• 1.3 降钙素原检测方法16-18
• 1.3.1 免疫比浊法16
• 1.3.2 化学发光16-17
• 1.3.3 胶体金17
• 1.3.4 荧光层析17
• 1.3.5 酶联免疫吸附实验17-18
• 1.4 单克隆抗体制备技术发展18-20
• 1.4.1 鼠源性单抗制备技术发展18-19
• 1.4.2 嵌合抗体单抗制备技术发展19-20
• 1.4.3 噬菌体抗体库单抗制备技术20
• 1.4.4 转基因小鼠制备全人抗体20
• 1.5 课题研究的意义及内容20-22
• 1.5.1 课题研究意义20-21
• 1.5.2 课题研究的主要内容21-22
• 第二章 材料和方法22-39
• 2.1 实验材料22-30
• 2.1.1 主要生物化学试剂22-24
• 2.1.2 主要缓冲液24-27
• 2.1.3 主要实验设备27-28
• 2.1.4 实验动物28
• 2.1.5 实验材料28-29
• 2.1.6 其他材料29-30
• 2.2 试验方法30-35
• 2.2.1 降钙素原单克隆抗体的制备30-35
• 2.3 单克隆抗体标记及配对35
• 2.3.1 抗体标记35
• 2.3.2 抗体配对35
• 2.4 降钙素原定量检测方法的建立35-37
• 2.4.1 初步反应模式的确定35-36
• 2.4.2 包被液及包被条件选择36
• 2.4.3 封闭液及封闭条件的选择36
• 2.4.4 包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度的确定36
• 2.4.5 反应模式的确定36-37
• 2.4.6 线性范围初步研究37
• 2.4.7 批内精密性实验37
• 2.4.8 回收率考察37
• 2.4.9 稳定性实验37
• 2.5 实验室临床标本检测37-39
• 2.5.1 灵敏度及特异性检测实验37-38
• 2.5.2 干扰因素检测实验38
• 2.5.3 临床标本检测实验38-39
• 第三章 结果和分析39-50
• 3.1 单抗制备39-42
• 3.1.1 抗原免疫结果39
• 3.1.2 间接ELISA检测方法的建立39
• 3.1.3 细胞融合结果39-40
• 3.1.4 染色体鉴定结果40
• 3.1.5 单抗亚型测定结果40
• 3.1.6 细胞株稳定性测定40-41
• 3.1.7 腹水制备结果效价测定41
• 3.1.8 腹水蛋白浓度及SDS-PAGE电泳鉴定结果41-42
• 3.2 降钙素原单抗的配对实验结果42
• 3.3 降钙素原定量检测方法的建立42-47
• 3.3.1 包被液及包被条件选择42-43
• 3.3.2 封闭液及封闭条件选择43-44
• 3.3.3 最佳抗体包被浓度和酶标浓度的确定44-45
• 3.3.4 反应时间的确定45
• 3.3.5 线性范围的初步确定45
• 3.3.6 批内精密性45-46
• 3.3.7 回收率46
• 3.3.8 稳定性46-47
• 3.4 实验室临床标本检测47-50
• 3.4.1 灵敏度及特异性47
• 3.4.2 干扰因素检测47-49
• 3.4.3 临床实验49-50
• 第四章 讨论50-52
• 4.1 单抗制备方法的选择50
• 4.2 试剂盒研究50-52
• 第五章 结论52-53
• 参考文献53-58
• 致谢58-59

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