酪氨酸激酶Src与E3泛素连接酶Trim13在天然免疫应答中的调控作用和机制研究

发布时间：2017-08-23 13:43

  本文关键词：酪氨酸激酶Src与E3泛素连接酶Trim13在天然免疫应答中的调控作用和机制研究

  更多相关文章： 天然免疫 Src Trim13 TBK1 STING

【摘要】：天然免疫(innate immunity)是机体抗感染的第一道防线,它可以在早期识别并消灭入侵的病原微生物。机体通过模式识别受体(PRRs)识别病原体的病原相关分子模式(PAMPs)随后激活相关信号通路,最终导致I型干扰素(IFN)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)等细胞因子的分泌,从而起到抵抗病原微生物感染的作用。但是过强的天然免疫应答也可以诱发机体产生炎症反应,造成病理性组织损伤。为了确保机体抵抗入侵的同时保护自身组织,天然免疫的调控显得至关重要。磷酸化修饰和泛素化修饰是两种重要的翻译后修饰,研究表明他们在机体的免疫应答过程中发挥着重要的调控作用,广泛的参与免疫应答的各个阶段。我们课题组的研究方向主要集中在研究翻译后修饰对于天然免疫的调控作用及相关分子机制,我们近三年研究了TANK结合酶1(TBK1)的磷酸化调控以及E3泛素连接酶Trim13介导的天然免疫调节。TANK结合激酶1(TBK1)作为抗病毒应答中关键的激酶分子,其活性的调控一直是分子免疫学研究的重点。然而到目前为止,关于TBK1活化的调控却知之甚少。因此在本论文的第一部分中将重点寻找并探索TBK1活化相关分子。我们首先从寻找天然免疫过程中TBK1的磷酸化位点出发,观察TBK1各个酪氨酸残基非活性突变体在抗病毒天然免疫应答中的作用,寻找到除Ser172外又一个对于TBK1活化十分重要的磷酸化位点——Tyr179。我们通过Western Blot以及ELISA技术确认TBK1的Tyr179的磷酸化对其Ser172位自我磷酸化以及随后I型IFN的产生具有重要意义。接下来我们通过质谱分析找到能与TBK1复合物相互作用的酪氨酸激酶——Src。Src激酶为Src家族激酶(SFK)的一员,由一个N端的SH4结构域、一个独有(unique)结构域、一个SH3结构域、一个SH2结构域以及C端的激酶结构域组成。作为一个非受体酪氨酸激酶,Src可以介导多种底物的酪氨酸磷酸化修饰从而参与调控细胞增殖、分化、存活、粘附以及细胞能动性等多种生命进程。为了探索Src激酶在抗病毒应答中的作用,我们利用Src抑制剂或构建Src缺失细胞系来抑制Src的活性或表达后,发现Src的缺失可以抑制TBK1-IRF3信号通路的活化以及I型IFN的产生,但是并不影响NF-κB及MAPK信号通路。最后我们通过荧光素酶报告基因实验证明Src作用于接头分子TRIF,MAVS,STING调控的信号通路而不影响MyD88信号通路。通过免疫共沉淀实验以及GST-融合蛋白,我们发现Src通过与TRIF,MAVS或STING形成复合物来间接调控TBK1的Tyr179磷酸化,最终调控TBK1-IRF3信号通路的活化和I型IFN的产生。通过本部分的研究,我们不仅发现了TBK1活化相关的又一磷酸化位点——tyr179,还寻找到调控该位点磷酸化的酪氨酸激酶——src。在受到病毒刺激后,src可以通过与接头分子trif,mavs或sting形成复合物来募集tbk1并介导其tyr179位磷酸化,随后促进tbk1在172位丝氨酸残基上发生自我磷酸化及活化,活化的tbk1则进一步激活转录因子irf3并促进其入核,最终促进i型ifn的产生。该研究深化了tbk1-irf3的活化机制,揭示了src在抗病毒天然免疫反应中的重要作用。除了磷酸化,泛素化修饰在天然免疫调控中也占有重要的地位。作为泛素化修饰过程中的关键分子,e3泛素连接酶也是天然免疫调控研究的重点对象。在第二部分的研究中,结合基因芯片及文献查阅结果,我们认为trim家族的e3泛素连接酶trim13可能参与调控天然免疫应答,因此我们对其展开了进一步研究。目前关于trim13在天然免疫中的调控作用及作用机制研究尚不完全。为了探索trim13在天然免疫相关信号通路中的作用,我们首先利用trim13特异性小rna干扰raw264.7细胞,发现trim13表达降低抑制vsv病毒诱导的ifn-β的表达,而促进hsv-1病毒及lps刺激后ifn-β及il-6的表达。相反,在raw264.7细胞中过表达trim13可以促进vsv病毒诱导的ifn-β的表达,而抑制hsv-1病毒及lps刺激后的ifn-β及il-6的表达。为了更深入的探索trim13的天然免疫调控功能,我们建立了trim13的基因敲除(trim13-ko)小鼠,并利用trim13-ko和野生型(trim13-wt)小鼠的腹腔巨噬细胞和骨髓来源的巨噬细胞来重复以上的刺激实验,得到了与干扰实验一致的结果。这些结果表明在多种巨噬细胞中trim13对于不同的病原微生物可能发挥着天然免疫应答双向调控作用。体内实验发现,在腹腔注射李斯特菌4小时后,trim13-ko小鼠血清中tnfα及il-6的含量明显高于trim13-wt小鼠,而腹腔注射vsv病毒12小时后,trim13-ko小鼠血清中tnf-α、il-6及ifn-β的含量明显低于trim13-wt小鼠。因此我们推测trim13对天然免疫过程具有双向调节作用,即他可以正向调控rna病毒诱导的天然免疫应答,而负向调控dna病毒及tlr配体诱导的天然免疫应答反应。接下来我们进一步研究了trim13介导的信号通路调控作用。在hek293t细胞中,高表达trim13能够明显抑制trif及sting诱导的ifn-β和nf-κb报告基因的活化,而促进rig-i诱导的的ifn-β和nf-κb报告基因的活化。但是trim13高表达对于myd88诱导的ifn-β和nf-κb报告基因的活化无显著影响。这提示我们trim13可能参与调控多条天然免疫相关信号通路。westernblot结果显示trim13过表达可以降低sting的表达水平,但是并不影响trif,myd88的表达水平,这提示我们trim13可能参与sting的泛素化修饰和降解。通过本部分的研究,我们发现e3泛素连接酶trim13在天然免疫应答中发挥着双向调控作用,而关于trim13在天然免疫应答信号通路中的作用机制,如Trim13的相互作用分子以及Trim13介导的泛素化修饰的蛋白底物和泛素化修饰类型,还有待于进一步的研究。
【关键词】：天然免疫 Src Trim13 TBK1 STING
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 缩略词表12-14
• 第一部分 酪氨酸激酶Src通过活化TBK1调控抗病毒天然免疫应答 .14-49
• 一、引言14-16
• 二、材料与方法16-25
• 三、实验结果25-46
• 四、讨论46-48
• 五、总结48-49
• 第二部分 E3泛素连接酶Trim13在天然免疫应答中的功能及机制研究49-75
• 一、引言49-51
• 二、材料与方法51-54
• 三、实验结果54-72
• 四、讨论72-74
• 五、小结74-75
• 参考文献75-81
• 综述 Trim蛋白与天然免疫及肿瘤的研究进展81-111
• 一.概述82-87
• 二.Trim蛋白在天然免疫中的作用87-93
• 三.Trim蛋白与肿瘤93-98
• 小结98-99
• 参考文献99-111
• 研究生期间发表的论文和国内外学术交流111-112
• 致谢112

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4 李s，

本文编号：725372