氧化还原状态对HepG2细胞中脱碘酶功能的影响及其机制

发布时间：2017-08-24 20:42

  本文关键词：氧化还原状态对HepG2细胞中脱碘酶功能的影响及其机制

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【摘要】：目的:甲状腺激素(thyroid hormone,TH)能够调节机体物质、能量代谢和细胞的氧化还原状态。脱碘酶在几乎所有外周组织的甲状腺激素代谢转化中发挥重要作用。伴随多种急慢性疾病发生的非甲状腺激素综合征(nonthyroid illness syndrome,NTIS)临床表现为三碘甲状腺氨酸(3,5,3’-triiodothyronine,T3)水平降低,四碘甲状腺原氨酸(3,5,3’,5’-tetraiodothyronine,T4)和促甲状腺激素(thyroid-stimulating hormone,TSH)含量无显著改变,提示其T4脱碘生成T3过程受阻。因此,本实验旨在探究H_2O_2和硫辛酸(lipoic acid,LA)处理对HepG2细胞中一型脱碘酶(type 1 deiodinase,D1)的影响,并探讨甲状腺激素转化对细胞糖代谢的作用。方法:采用H_2O_2(100μM、200μM、300μM,2 h)诱导HepG2细胞建立氧化应激实验模型,随后将其分为:H_2O_2组,H_2O_2+T3组,H_2O_2+T4组,LA组和H_2O_2+T4+LA组。DCFH-DA法测定胞内ROS水平,MTT法测定细胞存活率,采用试剂盒测定相关氧化还原状态指标、细胞糖吸收水平和T3含量,qRT-PCR法测定目的基因mRNA表达水平,放射性免疫法测定D1活性、rT3水平。结果:(1)各剂量T3显著改善了H_2O_2预处理HepG2细胞的氧化还原状态,提高细胞存活率,包括显著降低了胞内ROS和MDA水平,升高T-AOC、GSH-Px活力和GSH/GSSG比值,上调Nrf2、NQO1、HO-1和抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达,下调促凋亡基因Bax和Caspase3 mRNA表达;然而,相对更高剂量的T4仅对胞内ROS、MDA水平、Bax和Caspase3 mRNA表达有一定的降低作用,并未显著改善其他指标。(2)H_2O_2(200μM、300μM)显著降低了细胞D1 mRNA表达及活性,并抑制了T3和T4对D1的诱导,减少T4转化生成T3,但rT3反而表现出升高的趋势;此外,H_2O_2诱导氧化应激显著上调细胞炎症关键基因NF-κB、AP-1、p38 MAPK mRNA表达,下调TRβ1、TRα1、SRC-1 mRNA表达。(3)LA干预显著恢复了氧化应激引起的D1 mRNA水平及活性降低,提高了T3含量,降低rT3水平,并下调炎症通路基因、上调甲状腺激素相关受体及SRC-1 mRNA表达。(4)在LA干预条件下,T4上调了HepG2细胞糖代谢相关基因HK、GS mRNA表达,下调GLUT2 mRNA水平,同时上调胰岛素信号通路相关基因INSR、PI3K、GLUT4 mRNA表达,提高细胞胰岛素敏感性,促进葡萄糖吸收作用。结论:T3而非T4可以显著恢复氧化损伤HepG2细胞的氧化还原状态,提高细胞存活率,氧化应激降低了D1基因表达及活性,抑制T4向T3转化可能是其原因;氧化应激对D1的影响可能通过调节炎症通路、甲状腺激素受体及SRC-1的转录水平实现;LA干预能够有效调节细胞D1功能和TH代谢转化,从而改善细胞糖代谢。
【关键词】：甲状腺激素 一型脱碘酶 氧化应激 硫辛酸
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R335
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 论文缩略语中英文对照表7-8
• 1 绪论8-17
• 1.1 甲状腺激素的生物学作用研究进展8-10
• 1.1.1 甲状腺激素调节代谢的基本途径8-9
• 1.1.2 甲状腺激素对肝脏糖脂代谢的调节作用9-10
• 1.1.3 甲状腺激素对肝脏氧化还原状态的调节作用10
• 1.2 脱碘酶调节甲状腺激素转化的研究进展10-14
• 1.2.1 脱碘酶的种类及作用10-11
• 1.2.2 D1介导的甲状腺激素转化与代谢疾病的关联11-12
• 1.2.3 D1的转录与活性调节机制12-14
• 1.3 硫辛酸的生物功能研究进展14-15
• 1.3.1 硫辛酸简介14
• 1.3.2 硫辛酸的抗炎及抗氧化作用14-15
• 1.4 待解决的问题及研究内容15
• 1.5 立题意义和目的15-17
• 2 实验材料与方法17-22
• 2.1 材料与仪器17
• 2.1.1 细胞株和试剂17
• 2.1.2 设备与耗材17
• 2.2 实验分组与给药方案17-18
• 2.2.1 HepG2细胞氧化损伤模型的建立17
• 2.2.2 脱碘酶活性和T3/rT3测定17-18
• 2.2.3 甲状腺激素转化与细胞糖代谢的关系18
• 2.3 实验方法18-22
• 2.3.1 细胞培养18
• 2.3.2 噻唑蓝（MTT）法测定细胞存活率18-19
• 2.3.3 DCFH-DA法测定细胞内ROS水平19
• 2.3.4 细胞抗氧化物/酶及MDA含量测定19
• 2.3.5 细胞总RNA的提取及反转录19
• 2.3.6 实时荧光定量PCR19-20
• 2.3.7 放射免疫法（RIA）测定细胞D1活性20
• 2.3.8 酶联免疫吸附（ELISA）测定细胞T3含量20-21
• 2.3.9 RIA测定细胞rT3含量21
• 2.3.10 葡萄糖氧化酶法测定细胞葡萄糖吸收水平21
• 2.3.11 数据统计与分析21-22
• 3 结果与讨论22-50
• 3.1 T3和T4对氧化应激诱导HepG2细胞的恢复作用探究22-33
• 3.1.1 HepG2细胞氧化损伤模型的建立22
• 3.1.2 T3和T4对氧化应激细胞ROS水平的影响22-24
• 3.1.3 T3和T4对氧化应激细胞存活率的影响24-25
• 3.1.4 T3和T4对氧化应激细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响25-28
• 3.1.5 T3和T4对氧化损伤细胞氧化还原状态的影响28-30
• 3.1.6 T3和T4对氧化损伤细胞抗氧化相关基因mRNA表达的影响30-32
• 3.1.7 小结32-33
• 3.2 氧化应激对HepG2细胞D1功能和TH转化的影响33-40
• 3.2.1 H_2O_2对细胞D1活性和mRNA表达的影响33
• 3.2.2 H_2O_2对HepG2细胞中T3诱导D1作用的影响33-35
• 3.2.3 H_2O_2对HepG2细胞中T4诱导D1作用的影响35-36
• 3.2.4 H_2O_2对HepG2细胞T3和rT3生成的影响36-38
• 3.2.5 H_2O_2对HepG2细胞TRβ1、TRα1、SRC-1 和炎症通路关键基因表达的影响38-40
• 3.2.6 小结40
• 3.3 LA对氧化应激HepG2细胞D1功能和TH转化的调节作用40-44
• 3.3.1 LA对氧化应激HepG2细胞D1活性和mRNA表达的影响40-41
• 3.3.2 LA对氧化应激HepG2细胞T3和rT3生成的影响41-42
• 3.3.3 LA改善氧化应激HepG2细胞D1功能的机制探究42-44
• 3.3.4 小结44
• 3.4 LA提高TH转化对氧化应激HepG2细胞糖代谢的影响44-50
• 3.4.1 TH转化对氧化应激HepG2细胞糖吸收的影响44-45
• 3.4.2 TH转化对氧化应激HepG2细胞糖代谢相关基因表达的影响45-46
• 3.4.3 TH转化对氧化应激HepG2细胞胰岛素敏感性的影响46-47
• 3.4.4 TH转化对氧化应激HepG2细胞胰岛素信号通路表达的影响47-49
• 3.4.5 小结49-50
• 主要结论与展望50-51
• 致谢51-52
• 参考文献52-59
• 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文59

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本文编号：733062