PM2.5对HepG2细胞脂肪变和凋亡的影响及白藜芦醇干预研究
本文关键词：PM2.5对HepG2细胞脂肪变和凋亡的影响及白藜芦醇干预研究
【摘要】：目的：本研究采用HepG2细胞作为毒性评价模型,观察广州城区PM2.5对肝细胞脂肪变和凋亡的影响,研究PM2.5对肝细胞的毒性作用,揭示PM2.5促NAFLD发生的可能机制,并观察白藜芦醇对PM2.5诱导的肝细胞凋亡的干预效果,从对肝细胞的直接影响探讨PM2.5引起NAFLD的机制及其中医药防治方法。方法：1)PM2.5对HepG2细胞脂肪变的影响：采集广州市区大气中的PM2.5,首先用CCK-8法检测PM2.5刺激对HepG2细胞的毒性,确定PM2.5的使用浓度,然后观察PM2.5刺激24h后细胞内脂肪含量的变化。实验分组为阴性对照组和PM2.5组(PM2.5终浓度分别为6,25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml),采用油红O染色法观察HepG2细胞内脂滴变化,并用甘油三酯、总胆固醇试剂盒测定检测HepG2细胞内脂质聚集情况；最后用Real-time PCR法检测各实验组中HepG2细胞脂质合成关键分子LXRa和SREBP-1c的mRNA表达情况,初步探讨PM2.5作用的信号途径。2)PM2.5对HepG2细胞氧化应激和凋亡的影响：实验分组为阴性对照组和PM2.5组(PM2.5终浓度分别为12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)。采用H2DCF-DA荧光探针法检测PM2.5刺激4h后各组细胞胞内总ROS含量；采用酶标法检测PM2.5刺激8h后HepG2细胞内总SOD、GSH和MDA含量；运用Real-time PCR法检测PM2.5刺激4h后HepG2细胞SOD1、SOD2、GSH和CAT的mRNA表达情况；采用Annexin V-FITC/PI双染法以流式细胞术检测PM2.5刺激24h后HepG2细胞的凋亡情况：采用Western Blot法检测PM2.5刺激24h后HepG2细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Cytochrome C、Caspase 9和Caspase 3的蛋白表达量情况。3)白藜芦醇对PM2.5诱导的HepG2细胞氧化应激和凋亡的影响：用CCK-8法确定白藜芦醇的安全浓度,根据结果实验分为阴性对照组、PM2.5组(终浓度50μng/ml)和PM2.5+白藜芦醇组(PM2.5终浓度为50μg/ml,白藜芦醇终浓度分别为20μmol/l、40μmol/l和80μmol/l)。采用H2DCF-DA荧光探针法观察白藜芦醇干预后细胞内ROS含量变化；通过酶标法检测白藜芦醇对PM2.5引起的HepG2细胞氧化应激的影响,检测指标包括细胞内SOD含量和MDA含量；运用Real-time PCR检测白藜芦醇对HepG2细胞SOD1、SOD2和CAT的mRNA表达情况的影响；采用CCK-8法和Annexin V-FITC双标法以流式细胞术检测白藜芦醇对PM2.5诱导HepG2细胞凋亡的保护作用；采用Western Blot法检测白藜芦醇对HepG2细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Cytochrome C、Caspase 9和Caspase 3)的影响。结果：1)PM2.5对HepG2细胞脂肪变的影响：CCK-8结果显示,PM2.5刺激24h后,50μg/ml和100μg/ml PM2.5组的HepG2细胞存活率较阴性对照组显著降低,差异具有统计学意义(P0.05)；用6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml的PM2.5刺激HepG2细胞,油红O染色显示,PM2.5干预后HepG2细胞内橘红色脂滴明显增多,并出现脂滴融合现象；酶标法检测细胞内脂质含量,结果显示PM2.5组刺激后细胞内甘油三酯含量明显升高,与对照组比较有显著性差异(P0.05),而总胆固醇含量也有升高的趋势,但与阴性对照组比较差异无显著性(P0.05); Real-time PCR结果显示,PM2.5可以上调HepG2细胞脂质合成关键分子LXRα、SREBP-1c mRNA表达,与阴性对照组比较有统计学差异(P0.05),这可能是其使肝细胞胞内脂质含量增多的原因之一。2)PM2.5对HepG2细胞氧化应激和凋亡的影响：H2DCF-DA荧光探针染色后镜下观察结果显示,PM2.5干预后HepG2细胞内荧光强度明显增大,用酶标仪对ROS含量进行定量检测,结果也证实了细胞内ROS含量明显升高,且与阴性对照组比较有显著性差异(P0.01);酶标法检测细胞内SOD.MDA和GSH含量,结果显示PM2.5组刺激后细胞内SOD含量明显降低,与对照组比较有显著性(P0.01),MDA明显升高,与对照组比较有显著性差异(P0.01),但GSH含量与对照组无显著变化(P0.05); Real-time PCR结果显示,PM2.5可以下调HepG2细胞的抗氧化酶相关基因SOD1、SOD2、CAT mRNA表达,与阴性对照组比较有统计学差异(P0.05),而GSHmRNA与对照组比较无明显变化(P0.05); Annexin V-FITC/PI双染法结果表明,PM2.5干预后HepG2细胞凋亡率明显增加,与阴性对照组比较有统计学差异(P0.05)；Western Blot法结果显示,PM2.5可以上调HepG2细胞凋亡相关蛋白Cytochrome C、 Caspase 9、Caspase 3蛋白的表达量与Bax/Bcl-2比值,与阴性对照组比较有统计学差异(P0.05),上述结果提示通过引起细胞氧化应激从而诱导肝细胞凋亡可能是PM2.5造成肝细胞损伤的一个重要途径。3)白藜芦醇对PM2.5诱导的HepG2细胞氧化应激和凋亡的影响：CCK-8结果显示,白藜芦醇刺激24h后,0～80μmol/l白藜芦醇组的HepG2细胞存活率较阴性对照组无明显变化,差异无统计学意义(P0.05); H2DCF-DA荧光探针染色的镜下观察结果显示,PM2.5+不同浓度白藜芦醇组HepG2细胞内荧光强度明显减弱,而用酶标仪对ROS含量进行定量检测,结果也证实了细胞内ROS含量明显下降,且与PM2.5组比较有显著性差异(P0.01)；酶标法检测也发现白藜芦醇干预后HepG2细胞内SOD含量升高,与PM2.5组比较有显著性差异显著(P0.01), MDA含量则明显降低,与PM2.5组比较差异显著(P0.01); Real-time PCR结果显示白藜芦醇可以上调HepG2细胞的SOD1、SOD2、CAT的mRNA表达,与PM2.5组有统计学差异(P0.01),说明白藜芦醇可以抑制PM2.5引起HepG2细胞氧化应激；CCK-8法和Annexin V-FITC/PI双染法检测白藜芦醇对PM2.5引起的HepG2细胞凋亡的影响,结果显示白藜芦醇干预后HepG2细胞存活率升高,与PM2.5组比较有统计学差异(P0.05),肝细胞凋亡率较PM2.5组也有明显下降,差异有统计学意义(P0.01); Western Blot法结果显示,白藜芦醇可以下调HepG2细胞凋亡相关蛋白Cytochrome C、Caspase 9 Caspase 3蛋白的表达量与Bax/Bcl-2比值,与阴性对照组比较有统计学差异(P0.05),说明白藜芦醇可通过抑制氧化应激进而减少PM2.5引起HepG2细胞凋亡,保护肝细胞。结论：1)PM2.5可诱导HepG2细胞脂肪变,该过程可能与PM2.5上调脂质合成关键分子LXRa和SREBP-1c mRNA表达有关：2)PM2.5可能通过抑制HepG2细胞的抗氧化能力(下调SOD1、SOD2和CAT表达)引起细胞氧化应激,进而诱导肝细胞凋亡；3)白藜芦醇对PM2.5诱导的HepG2细胞氧化应激和凋亡具有改善作用,其保护机制可能是通过减少PM2.5引起的氧化应激而实现的。
【关键词】：PM2.5 肝细胞 脂肪变 凋亡 白藜芦醇
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：
- 摘要7-10
- Abstract10-14
- 一 前言14-20
- 1 PM的定义、分类及其特性14-15
- 2 PM2.5对人体健康的影响15-16
- 2.1 PM2.5对肺部的损伤15-16
- 2.2 PM2.5对心血管的损伤16
- 2.3 PM2.5对肝脏的损伤16
- 3 NAFLD16-18
- 4 白藜芦醇与其抗氧化作用18-19
- 5 研究意义19-20
- 二 论文总体技术路线20-21
- 三 材料与方法21-24
- 1 实验仪器和材料21-23
- 1.1 实验仪器21
- 1.2 主要试剂21-23
- 1.3 实验细胞23
- 2 主要试剂的配制23-24
- 2.1 白藜芦醇母液(80mmol/l)23
- 2.2 油红O染液23-24
- 四 实验方法和步骤24-36
- 1 PM2.5的采集与处理24-25
- 1.1 采集地点和时间24
- 1.2 灰霾天气判定24
- 1.3 滤膜前期处理24
- 1.4 采集方法24
- 1.5 PM2.5颗粒的制备24
- 1.6 PM2.5悬浮液的配制24-25
- 2 HepG2细胞的培养25
- 3 PM2.5对HepG2细胞脂肪变的影响25-28
- 3.1 油红O染色检测HepG2细胞内脂质堆积情况25
- 3.2 HepG2细胞内甘油三酯和总胆固醇含量的测定25-26
- 3.3 Real-time PCR检测HepG2细胞内LXRα、SREBP-1c mRNA的表达26-28
- 4 PM2.5对HepG2细胞氧化应激和凋亡的影响28-34
- 4.1 H2DCF-DA染色法测定PM2.5刺激后HepG2细胞内活性氧ROS28-29
- 4.2 PM2.5对HepG2细胞内SOD、MDA、GSH含量的影响29-32
- 4.3 Real-time PCR检测PM2.5对HepG2细胞SOD1、SOD2、GSH、CAT mRNA的影响32-33
- 4.4 Annexin V-FITC/PI双染法检测PM2.5刺激后的细胞凋亡率33
- 4.5 Western Blot检测PM2.5刺激HepG2细胞后的凋亡相关蛋白表达33-34
- 5 白藜芦醇对PM2.5诱导的HepG2细胞氧化应激和凋亡的影响34-35
- 5.1 CCK-8法检测白藜芦醇对HepG2细胞的毒性34
- 5.2 H2DCF-DA荧光探针法检测白藜芦醇干预后HepG2细胞内活性氧ROS34
- 5.3 HepG2细胞中SOD、MDA含量的测定34-35
- 5.4 Real-time PCR检测白藜芦醇对HepG2细胞SOD1、SOD2、CAT mRNA的影响35
- 5.5 CCK-8法检测白藜芦醇对PM2.5诱导HepG2细胞凋亡的保护作用35
- 5.6 Annexin V-FITC/PI双染法检测白藜芦醇干预后的细胞凋亡率35
- 5.7 Western Blot检测白藜芦醇干预后的凋亡相关蛋白表达35
- 6 统计学分析35-36
- 五 结果36-51
- 1 PM2.5对HepG2细胞活性的影响36
- 2 油红O染色检测HepG2细胞内脂质变化36-37
- 3 PM2.5对HepG2细胞甘油三酯和总胆固醇含量的影响37
- 4 PM2.5对HepG2细胞LXRα、SREBP-1c mRNA表达的影响37-38
- 5 PM2.5对HepG2细胞氧自由基生成的影响38-39
- 6 PM2.5对HepG2细胞SOD、MDA、GSH含量的影响39-41
- 7 PM2.5对HepG2细胞SOD1、SOD2、GSH、CAT mRNA表达的影响41
- 8 PM2.5对HepG2细胞凋亡的影响41-42
- 9 PM2.5对HepG2细胞凋亡相关蛋白表达的影响42-44
- 10 白藜芦醇对HepG2细胞的毒性研究44
- 11 白藜芦醇对PM2.5诱导的ROS生成的影响44-45
- 12 白藜芦醇对HepG2细胞内SOD、MDA含量的影响45-46
- 13 白藜芦醇对HepG2细胞SOD1、SOD2、CAT mRNA表达的影响46-47
- 14 白藜芦醇对PM2.5诱导的HepG2细胞毒性的保护作用47-48
- 15 白藜芦醇对PM2.5诱导HepG2细胞凋亡的影响48
- 16 白藜芦醇干预对HepG2细胞凋亡相关蛋白表达的影响48-51
- 六 讨论51-55
- 1 PM2.5对HepG2细胞脂肪变的影响及机制52
- 2 PM2.5对HepG2细胞氧化应激和凋亡的影响52-54
- 3 白藜芦醇干预研究54-55
- 七 结论55-56
- 参考文献56-62
- 攻读学位期间发表的论文62-63
- 附录 英文缩略词表63-64
- 致谢64
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